转录因子KLF4与肿瘤EMT的分子机制研究进展

任晓丽，陈丽君，宋 晖，刘海霞，陈必良

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032)

【妇幼综合研究】

转录因子KLF4与肿瘤EMT的分子机制研究进展

任晓丽，陈丽君，宋 晖，刘海霞，陈必良

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032)

上皮间质转化(EMT)是一种在胚胎发育和损伤修复过程中的生理性改变，其是肿瘤发生和发展过程中的一种常见现象，但作用及机制尚不完全清楚。目前已经发现多个转录因子通过调控下游靶基因参与了EMT的发生过程，其中Krüppel样因子4(KLF4)能够活化上皮基因的表达，同时抑制间质基因的表达，在EMT发生过程中发挥着关键作用，可能是肿瘤治疗的新靶点。该文系统地总结了转录因子KLF4在肿瘤EMT发展过程中的作用及分子机制。

转录因子KLF4；肿瘤；上皮间质转化；分子机制

上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一种在胚胎发育和损伤修复过程中的生理性改变，其为肿瘤发生和发展过程中的一种常见现象，因此，其关键调控机制成为目前肿瘤研究的热点之一。目前已经发现多个转录因子能够通过转录调控下游靶基因，参与EMT的发生过程，包括Snail1、snail2、ZEB1、Twist等。新近研究发现，Krüppel样因子4(Krüppel-like factor，KLF4)能够活化上皮基因表达的同时抑制间质基因的表达，调控EMT的发生[1-2]，并且有研究发现KLF4在多种肿瘤的EMT过程中发挥着关键调控作用[1]，但KLF4在肿瘤EMT中的具体作用仍少有总结。现对KLF4在肿瘤EMT中的作用及其相关机制进行综述。

1上皮间质转化与肿瘤恶性表型

EMT在胚胎发育过程中对于组织形态的发生有着重要的作用，最早由发育生物学者Garry Greenburg与Elisabeth Hay提出。近年研究发现，在成年人组织中EMT与纤维化疾病及肿瘤进展密切相关[3]。EMT包含一系列细胞学的改变，例如细胞间粘附的降低、细胞极性的丧失以及细胞基质的增加。EMT的标志性改变是上皮标志性蛋白的丧失，同时伴随着粘附链接蛋白的丧失，包括E-cadherin、β-catenin和p120 catenin等以及紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudins表达的减少和异常。

EMT是一个严密的可逆转化过程，表现为排列良好紧密连接的上皮细胞转变成为无序的间质细胞。在这个过程中，紧密连接蛋白的表达减少或者位置异常能够引起细胞紧密连接的破坏。与此类似，由E-cadherin等组成的粘附连接复合体发生解体，伴随着细胞顶底极性的丧失和细胞骨架的重构。此后细胞获得纺锤状的、成纤维细胞样的间质细胞形态，并表达间质细胞的成分蛋白，包括N-cadherin、vimentin、fironectin等。通过诱导多种调节EMT因子的表达，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在EMT的发生过程中发挥着调控作用。受到TGF-β调控的因子包括Snail and Slug。除了这些转录调节机制，TGF-β-smad2的过度活化能够抑制一些重要的上皮标志基因如E-cadherin等，从而促进EMT的发生和建立。

Mjaatvedt等于1989年提出EMT与肿瘤细胞的增殖、侵袭和浸润密切相关。EMT在实体瘤的侵袭前缘表现为上皮细胞标志的丧失和间质细胞标志的获得，并在肿瘤的发生过程中发挥关键作用。获得间质特征的细胞能够从原位癌中游离出来并进一步侵入临近组织，进入循环系统以及向远端器官定植。EMT过程伴随着上皮细胞丧失细胞间连接和顶底极性，细胞骨架的重建和成纤维细胞表型的形成，并能够影响一系列的相关基因。通过抑制细胞连接复合物中E-cadherin、ZO-1、claudin-1等的表达，细胞失去细胞间的连接并相互分离。通过促进间质分子N-cadherin、vimentin、α-SMA以及细胞外基质collagens Ⅰ、Ⅱ的表达，细胞迁移能力增强并能够侵入细胞外基质[4]。

在EMT过程中，E-cadherin的表达受到多种转录因子的抑制，包括锌指结构转录因子中的E结合锌指蛋白(zinc finger E-box-binding protein，ZEB)、snail和Twist等。这些转录因子是TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)等信号通路的下游蛋白。E-cadherin的丧失能够将位于胞内与其相连的β-catenin释放至胞浆，并进一步进入细胞核调控一系列基因的表达，促进肿瘤的进展。因此，深入研究这些上游转录因子在肿瘤EMT过程中的作用及其机制对肿瘤治疗具有重要意义。

2对转化生长因子β的概述

TGF-β属于一个由超过40个分泌因子组成的超家族，包括TGF-β，bone morphogenetic proteins(BMPs)、myostatin等。这些多功能的细胞因子控制多种细胞功能，包括增殖、凋亡、干细胞维持、细胞分化、迁移以及免疫系统的调节。TGF-β分子最初产生时是无活性的TGF-β形式，由TGF-β和latency associated proteins(LAPs)结合组成。

TGF-β可以通过多种途径得到激活。第一种，在thrombospondin-1(TSP-1)的诱导下，LAPs可发生形式上的改变，并进一步在蛋白酶介导下发生剪切；第二种，在外伤或炎症条件下，αVβ6整联蛋白表达上调，与TGF-β结合并活化后者；第三种，当局部微环境中的pH降低或者放射诱导活性氧产生时，TGF-β也能够被活化；另外，肌纤维在基底部的机械压缩也能够活化TGF-β。以上4种机制最终都能够引起具有活性的TGF-β的释放，并与TGF-β受体结合而引起下游信号通路的激活。

2.1转化生长因子β的双向作用

TGF-β最初被认为是能够引起成纤维细胞增殖和转化的细胞因子。一种已经得到广泛认可的观点为TGF-β在肿瘤的发生和进展中发挥着基础性的作用。1994年Sporn等的研究表明，TGF-β在肿瘤的增值和转化过程中可能有正反两方面的作用。在起始阶段，TGF-β对正常和发生恶化前的上皮细胞增殖具有抑制作用；然而随着肿瘤细胞的发展，TGF-β在肿瘤细胞局部分泌增多，并开始促进肿瘤细胞的形态转变。同时TGF-β的功能与组织的类型和遗传背景关系密切。在正常的上皮细胞中，TGF-β抑制细胞的增殖。Pera等最早于1984年在小鼠上皮中发现过表达TGF-β可以抑制角质细胞的增殖，并且在小鼠受到致癌因子刺激后，可以减少上皮肿瘤发生和异常增生发生的可能。相反，当TGF-β受体活性受到抑制后，则能够促进上皮细胞的异常增生。以上结果提示TGF-β是一种肿瘤抑制因子。

2.2转化生长因子β和上皮间质转化的信号通路

在对哺乳类动物上皮细胞的早期研究中TGF-β包括NmuMG细胞和EpRas细胞。TGF-β可以诱发几乎所有的EMT标志性改变，比如细胞粘附连接和紧密连接的丧失、细胞骨架的适应性改变、纺锤状形态的出现和细胞运动性的增强。当把EMT理解为在单一细胞因子TGF-β作用下细胞分化的一种过程时，EMT将更好理解和分类。在这种假设的情况下，TGF-β诱导其他生长因子、细胞因子和趋化因子的产生和分泌。因此，这些因素共同作用参与了EMT的建立和肿瘤细胞的侵袭浸润。

作为诱导EMT的一个典型的因子，TGF-β通过信号转导分子SMAD和非SMAD两条信号路径重建细胞骨架和胞外基质，并最终调控控释细胞活动和侵袭的基因[5]。SMAD蛋白在TGF-β诱导EMT过程中发挥重要作用，通过抑制smad2、smad3、smad4和过表达smad7能够阻断NmuMG细胞的EMT过程[6]。另外，TGF-β也能够直接调控大部分的EMT转录因子(EMT-TFs，EMT transcription factors)。TGF-β通过smad信号上调HMGA2(high mobility group A2)启动细胞的EMT，同时Thuault等于2006年在相关的体内实验中也证实HMGA2的过表达能够引起细胞侵袭。TGF-β和HMGA2的另一个作用对象是Snail1。Smad和snail联合作用则能够抑制E-cadherin和adenovirus receptor(CAR)的表达。

通过非经典信号路径TGF-β也可以诱导EMT的发生。TGF-β通过活化MAPK/PI3K路径调节细胞骨架的重组、细胞的迁移和侵袭，而这些正是EMT的特征性变化。同时，TGF-β还能够通过ERK/MAPK and p38 MAPK路径促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭。TGF-β也能够上调Sox4的表达，从而在EMT过程中调节一组间质基因。同时，Sox4能再次活化经典TGF-β信号构成一个反馈路径，使细胞保持EMT状态[7]。在EMT过程中，TGF-β能够活化TβRII，而TβRII通过磷酸化极性复合体蛋白Par6募集Smurf1泛素连接酶，后者促进RhoA降解并松解细胞骨架网络，从而溶解紧密连接，最终破坏细胞极性，导致EMT发生。

3对Krüppel样因子4的概述

Krüppel样因子C端具有3个锌指状结构域，N端有转录活化结构域。KLFs通过与启动子结合能够调节一系列基因的表达，并影响细胞增殖、分化等多种细胞生物学过程。到目前为止，在人体中已有17种KLFs得到确认，其中KLF4最初也称为gut-enriched Krüppel-like factor。KLF4含有5个外显子，其cDNA编码一个包含有470个氨基酸的蛋白质。在KLF4中有多种结构域，包括转录活化和抑制结构域、DNA结合结构域等。由于同时具有转录活化和抑制两种结构域，KLF4既能活化也能抑制其下游的调控靶基因。最近的研究发现，KLF4在多种消化道癌症中的表达呈下调趋势，并且通过调控其靶基因，其在消化道肿瘤细胞的发生、增殖、分化等过程中发挥重要作用[8]。

3.1 Krüppel样因子4在上皮间质转化中的作用

EMT的发生过程中有大量的转录因子参与，包括Snail1、snail2、ZEB1、Twist等，而KLF4在EMT过程中则能够活化上皮基因的表达，同时抑制间质基因的表达[1，9-10]。在肝细胞癌中，过表达KLF4能够抑制其间质特征并促使细胞表现出更多的上皮特征，同时抑制其迁移和侵袭、增殖及肺转移等。进一步的研究证实，KLF4能够结合于Slug启动子上并抑制其活性，而Slug的表达能够部分逆转KLF4引起的细胞表现改变[9]。在小鼠乳腺癌模型中，KLF4通过减少Snail的表达抑制EMT，而snail是介导EMT的重要转录因子[9]。KLF4在E-cadherin启动子上的结合位点与ZEB2的有重合，两者对E-cadherin启动子的的活性发挥着相反的影响[1]。随着研究的深入，目前已发现KLF4对EMT过程中的许多关键性的分子都具有转录调控作用，包括E-cadherin、N-cadherin、vimentin、β-catenin等[10]。

3.2 Krüppel样因子4在肿瘤发生中的作用

KLF4作为一个转录因子在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着肿瘤抑制因子的作用[13]。在肿瘤的早期发生过程中，KLF4的表达即表现出下调的现象。随着肿瘤形成并进入进展期，KLF4的表达呈现出逐渐降低的趋势。针对胃癌的研究发现，KLF4随着肿瘤从Ⅰ期发展到Ⅳ期，其表达有明显的渐进性消失的趋势[2]。同样，在人胃癌细胞系中，KLF4无论在mRNA水平还是蛋白水平都表现出表达减少的现象。与周围正常黏膜中的表达相比，KLF4在肠癌中的表达也有明显的降低。Wei等于2006年在对肠癌组织的研究中发现，与正常组织相比KLF4的表达降低甚至消失。Patel等于2010年在基础研究中同样发现，过表达KLF4能够降低癌细胞克隆形成，抑制细胞迁移和侵袭。作为一种肿瘤抑制因子KLF4能够抑制FOXM1的转录，而后者作为致癌因子对肿瘤的发生和进展有重要影响。Katz等于2005年通过基因技术获得了KLF4突变的小鼠模型，发现小鼠胃上皮增殖明显，并出现了异常分化[11]。

3.3 Krüppel样因子4在增殖和分化中的作用

KLF4对肿瘤发生的影响主要是通过抑制细胞周期、促进细胞凋亡以及抑制增殖实现的。食管癌细胞中KLF4表达的减少能够使细胞增殖活跃并降低细胞的粘附能力。同时，过表达KLF4则能够促进食管癌细胞中DNA的修复并抑制其增殖，促进其凋亡。KLF4也能够调控细胞周期。过表达KLF4的细胞会停留在G1期和S期的交界。CDKs(cyclin-dependent kinases)作为一种调节细胞周期的激酶，其自身活性受到KLF4的调控。KLF4也能够促进p21等CDKs抑制因子的表达并抑制DNA的合成。除了促进上述因子的表达，KLF4也抑制一些促进细胞周期调节因子的表达。通过竞争性结合于细胞周期蛋白D1的启动子，KLF4可以抑制其在mRNA和蛋白水平的表达。与此同时，KLF4在头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌等肿瘤中能够促进肿瘤发育及进展，从而扮演致癌基因的角色。KLF4在肿瘤细胞中功能的发挥受到肿瘤类型以及肿瘤微环境等多种因素的影响。

KLF4在终末分化的表皮层中表达明显。Segre等于1999年研究发现当KLF4表达缺失时，小鼠表皮的晚期分化会遭到破坏，进而使得皮肤屏障功能丧失，从而使得新生小鼠迅速死亡。在消化道癌症中，KLF4起着促进癌细胞分化的作用。在食道癌中，过表达KLF4能够通过促进鳞状上皮细胞分化相关基因SPRR1A(small proline-rich protein 1A)等的表达诱发细胞的分化。在癌干细胞中，KLF4仅在球形细胞中过表达，并且敲低其表达能够明显地减少癌干细胞的标志分子、降低其药物抵抗以及迁移等[12]。

3.4 Krüppel样因子4在notch、wnt信号中的作用

Notch信号在细胞产生、增殖及分化过程中发挥重要作用，同时在很多种肿瘤的形成及发展过程中扮演重要角色。在notch信号活化的经典路径中，首先是notch蛋白残基和受体的交联，然后蛋白水解并且notch细胞内结构域转移入细胞核。在细胞核中，notch与DNA结合蛋白协同调控目的基因的转录表达。近来的研究发现，notch信号路径在生理及病理条件下都参与EMT的发生[13]，并且KLF4与notch之间的关系可能与KLF4在EMT中的作用有关。在小肠的发育过程中，notch信号调节高柱状细胞分化可能是通过KLF4实现的，因为KLF4能够抑制小肠细胞的增殖及肠上皮细胞的终末分化[14]。在角质形成细胞中，KLF4结合至notch1的启动子上抑制其转录表达，从而下调notch1基因抑制肿瘤的发生[15]。KLF4在超过70%的乳腺癌细胞中表达，发挥致癌基因的功能并有助于维持乳腺癌干细胞。下调KLF4的表达能够抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。2009年Liu等更进一步的研究证实，notch信号在KLF4介导的细胞迁移和侵袭中发挥关键作用。KLF4能够直接结合于notch1的启动子上，并且在癌细胞中抑制KLF4的表达能够引起notch1的表达减少。另一方面，在肠癌细胞中过表达notch则能够降低KLF4的表达水平，抑制其活性并促进细胞增殖。因此，KLF4与notch也能够相互影响，并最终影响到KLF4在EMT中的作用。

参与调控癌细胞过程一个重要的信号通路是经典wnt/β-catenin信号路径。在癌症发生过程中，活化的wnt信号能够促进β-catenin的核转移，并引起与肿瘤侵袭转移有关的基因表达。目前，有研究证实wnt/β-catenin信号路径参与了癌细胞的EMT过程[16]，并且与KLF4信号有关联。在许多正常细胞和癌细胞中，KLF4能够激活β-catenin与启动子的结合。当直肠癌中的肿瘤抑制因子APC(adenomatous polyposis coli)发生突变失活时，wnt信号会因为β-catenin的聚集而持续升高。在肠癌细胞系中，APC通过活化KLF4启动子能够调节KLF4的表达。过表达KLF4能够降低β-catenin的蛋白和mRNA水平，同时下调KLF4的表达则促进β-catenin的聚集。以上结果表明KLF4可能是通过APC/β-catenin信号发挥抑制作用。另外，Zhang等在2006年还有研究发现，在保证正常小肠细胞内环境稳定的过程和直肠癌发生的过程中，KLF4与β-catenin的交互影响都发挥着关键作用。因此，KLF4与wnt信号的作用可能也参与EMT的发生。

3.5 Krüppel样因子4与转化生长因子β之间的联系

目前一个公认的观点是TGF-β在肿瘤发生发展过程中具有双重作用。在起始阶段，它抑制细胞增殖，促进凋亡，从而抑制肿瘤形成，但是在肿瘤发展的后期，TGF-β呈现为一种过表达的状态，并通过诱导EMT促进肿瘤的发展。有研究表明，KLF4能够影响TGF-β引起的EMT，并且减少KLF4的表达能够加快TGF-β诱发EMT的过程。在TGF-β诱导的前列腺癌EMT模型中，Slug是调控EMT起始的关键调控分子，而TGF-β诱导的KLF4的表达降低是此过程进行的必要条件[17]。受到TGF-β刺激后，KLF4的表达水平通过泛素蛋白酶系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)发生降解[18]。在血管平滑肌细胞的分化过程中，KLF4通过活化Smad2/3和p38MAPK路径传递TGF-β信号，同时它也可以直接结合于TGF-β启动子上调控smad信号。

综上所述，KLF4在肿瘤EMT过程中发挥关键作用，其与TGF-β信号之间有密切的交叉反应，可能通过与TGF-β信号协同作用影响肿瘤细胞EMT过程，但其具体机制仍需要进一步研究。

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[专业责任编辑：安瑞芳]

Research progress of molecular mechanism of transcription factor KLF4 and epithelial mesenchymal transition

REN Xiao-li; CHEN Li-jun; SONG Hui; LIU Hai-xia; CHEN Bi-liang

(Department of Obstetrics and Gynecology, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Shaanxi Xi’an 710032, China)

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is a physiological change during embryonic development and injury repair process, and it is a common phenomenon in the process of occurrence and development of tumors. But its role and mechanism are still unclear. Currently, it has been found that several transcription factors are involved in EMT process through the regulation of downstream target genes. Among them, Krüppel like factor 4 (KLF4) can active the epithelial gene expression while inhibit stromal gene expression, which plays a key role in EMT genesis and may be the new target for tumor therapy. The aim of this review was to systematically summarize the role and molecular mechanism of transcription factor KLF4 in the development of EMT in tumor.

transcription factor KLF4; tumor; epithelial-to-mesenchymal transition (EMT); molecular mechanism

2016-05-26

国家自然科学基金资助项目(项目编号：81301921)；陕西省自然科学基金资助项目(项目编号：2013JM4023)

任晓丽(1983-)，女，主治医师，在读硕士研究生，主要从事宫颈癌的研究。

陈必良，教授/博士生导师/主任医师；宋 晖，副教授/副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.11.045

R730.26

A

1673-5293(2016)11-1426-04