质谱技术在病原微生物诊断中的应用

吴　傲，张丽军



质谱技术在病原微生物诊断中的应用

吴傲1,2，张丽军1,2

质谱技术因其高灵敏度、特异性、自动化和高通量等特点，被广泛用于病原微生物蛋白质、多肽等的研究，为病原微生物诊断提供了新技术。本文以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)和电喷雾(ESI)三重四极杆多反应监测(MRM)质谱技术在微生物诊断中的研究进展进行系统综述。

MALDI-TOF；MRM技术；微生物；诊断

病原微生物引起的感染性疾病对人类的危害越来越大。近年来，随着抗菌药物的滥用导致多种细菌耐药以及新型细菌的出现，使得临床上对细菌种类的鉴定工作更加困难。传统的微生物诊断方法操作过程复杂，所需时间较长，诊断结果存在一定的误差，在一定程度上影响了病原微生物的诊断以及疾病的控制。因此，临床上急需一种快速、准确的鉴定方法来改善传统方法的不足。质谱技术具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量等特点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术已经成为商业的微生物鉴定技术；电喷雾离子化(ESI)质谱的多反应监测(MRM)技术正渐渐用于微生物的定量分析。本文从病原微生物诊断的常用方法及其缺陷、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术和ESI的MRM技术在病原微生物诊断中的应用进行系统综述，为临床和科研工作者提供帮助。

1　病原微生物诊断的常用方法及其缺陷

传统的病原微生物鉴定，主要依靠形态学特征、革兰染色、生理生化反应特征以及血清学反应。但这些鉴定方法一般需要数天才能完成，而且鉴定程序繁琐[1-2]。近年来随着分子生物学技术的发展，病原微生物鉴定技术也取得了进展：聚合酶链式反应(PCR)技术、实时荧光定量PCR等[3-4]。但是PCR技术由于扩增受外界环境的影响较大，因此仍需寻找高灵敏度、快速和受外界环境影响较少的方法。

2　MALDI-TOF技术在病原微生物诊断中的应用

MALDI-TOF在西方国家临床微生物实验室逐渐得到普及，国内研究学者们也逐渐重视其在微生物领域的应用[5-7]。MALDI-TOF能够用于病原微生物诊断主要基于以下几点：不同微生物指纹图谱的差异；指纹中存在种属、亚种间特异的模式峰；相同的培养和操作条件下其鉴定结果具有可重复性。该方法广泛用于细菌、真菌等的临床诊断。

2.1在细菌诊断中的应用

2.1.1MALDI-TOF分析细菌成分MALDI-TOF能完成对细菌多种成分的分析，包括蛋白质、多肽、DNA和RNA及其他能被离子化的分子。细菌蛋白质经过裂解、酶切等过程变成适合质谱分析的肽段，然后用MALDI-TOF采集肽段的质量/电荷(m/z)谱图(又叫指纹谱)，将每种细菌特定的指纹谱存入数据库中。临床样品分析时，将MALDI-TOF采集的指纹谱与数据库中进行比对，从完成对病原体的鉴定[8]。此外，每种细菌有其特有的DNA，通过聚合酶连反应(PCR)技术先扩增出特异的核苷酸片段，然后再进行MALDI-TOF检测[9]，数据库比对以鉴定相应的病原体。再有，细菌鉴定中MALDI-TOF还用于代谢产物的分析，但是由于细菌的代谢产物在机体内裂解物或培养物中的含量较低，故应用比较局限[9]。

2.1.2应用用于尿路感染中细菌的检测：王琳等在MALDI-TOF在中段尿样本细菌直接检测中的应用中[10]，阐述了MALDI-TOF通过分析细菌蛋白质，从而可以直接检测不同种类的细菌，并且对混合感染的样本有一定的鉴别能力，是尿路感染临床样本细菌鉴定的一大进步。

用于沙门氏菌的检测：战晓微等在沙门氏菌MALDI-TOF检测方法的建立一文中提出[11]，利用MALDI-TOF方法对沙门氏菌多肽段进行分析，可用于食品中沙门氏菌的快速准确检测。

用于肺炎链球菌的检测：Branda等对116例非肺炎链球菌用MALDI-TOF检测[12]，只有一例未识别，并且95例肺炎链球菌的检测成功率达到100%。

用于结核分枝杆菌的检测： Sharma等对结核分枝杆菌细胞膜及膜相关蛋白质进行检测时[13]，MALDI-TOF技术相对于传统的测序方法以及色谱法来说，不仅能快速检测大量未知蛋白质，而且对蛋白质的种类能进行分离，这体现了MALDI-TOF技术在鉴定细菌方面的优势。

总体来说：MALDI-TOF不但可快速鉴定培养好的纯菌落，还可以直接从临床样本中检测微生物。对不同菌株进行鉴定，需氧菌鉴定的正确率高于厌氧菌，革兰阳性菌高于革兰阴性菌[14-15]。对于直接从阳性血培养检测细菌，MALDI-TOF鉴定细菌的正确率为31.8%～95%不等[18-19]。阳性血培养瓶经简单预处理后进行MALDI-TOF鉴定，阴性杆菌和阳性球菌的鉴定正确率分别为90%和73%[20]。

2.2在真菌诊断中的应用

2.2.1MALDI-TOF分析真菌成分MALDI-TOF用于真菌诊断时主要是对真菌全细胞蛋白、细胞裂解产物进行检测。叶丽艳等通过获取真菌全细胞蛋白(主要为核糖体蛋白)[21]，共鉴定出真菌1 254株，质谱技术鉴定真菌共1 198株，占95.53%，未鉴定出真菌占4.47%；应用质谱技术鉴定的真菌中以假丝酵母菌属为主，共1 125株，占93.91%。Marklein等通过MALDI-TOF技术[22]，对酵母菌裂解物进行处理分析，鉴定准确性达到92.5%。

2.2.2应用用于酵母菌的检测：目前大部分文献报道MALDI-TOF主要是用于酵母菌的检测[23]。已有许多研究对MALDI-TOF 用于酵母菌鉴定的能力进行了评估，发现其鉴定酵母菌的准确性高，准确率达到85.2%[24]。

用于丝状真菌的检测：Chierico等对20种共230株丝状真菌进行MALDI-TOF MS鉴定[25]，他们分别对培养了48 h、72 h、96 h 和120 h 的菌落进行检测，准确率达到85.9%。

用于皮肤癣菌的检测：Alshawa 等对360株临床分离的皮肤癣菌和21株小柱孢属菌进行MALDI-TOF-MS 检测[26]，鉴定到种的准确率分别为91.9%(331/360)和85.7%(18/21)，27株皮肤癣菌和3株小柱孢属菌没有得到鉴定是因为没有获得质谱信号，而只有2株(0.5%)皮肤癣菌鉴定错误。

此外，为了提高真菌的检出率，研究者在样品收集和提取方面进行了大量的探索。如Lavergne等在发现念珠菌血液标本中混杂的人及肉汤培养中的蛋白可干扰微生物质谱从而影响其鉴定结果后[27]，通过反复离心以及样品冲洗、改良样品提取方法，从而将真菌的检出率提高到100%。

2.3MADLI-TOF质谱技术的局限性以MADLI-TOF为代表的蛋白质谱技术具有快速、准确、灵敏、高通量等特点，加上其自动化和低消耗的优势而逐渐在临床微生物实验室被推广，并且有望在不久的将来取代传统的微生物鉴定方法。但是，现阶段MADLI-TOF在微生物鉴定中还存在一定的局限性，MADLI-TOF在对病原菌亚种上的鉴定、病原菌的耐药检测、人体无菌部位样品的直接鉴定以及混合病原菌物种的鉴定方面仍有局限[28]；国内由于该技术的研究和应用刚刚起步，尚未建立各种细菌菌株的质谱图数据库，而且不同国家和地区的菌株可能存在明显的地理差异[29]；一些罕见菌种或新型细菌的图谱尚未被现有数据库收录，从而导致鉴定困难；含有混合菌种的血培养样本难以准确鉴别；同一菌属中相近的菌种容易错误鉴定[30]等。因此有必要发展新的技术以补充MALDI-TOF的不足。

3　MRM技术在病原微生物诊断中的应用

目前用于病原微生物分析的另一主要技术是基于质谱多反应监测(MRM)技术，该技术利用目标分析物的分子结构信息，设定离子对及其质谱检测方法，然后对设定的离子对进行质谱信号的采集，该技术具有高灵敏度、高特异性的特点，是药物定量分析的主要手段[31-32]。近年来，随着质谱灵敏度、检测质量范围的提高，MRM定量技术受到了广大蛋白质研究者的关注[33-34]。

3.1病原微生物的特征蛋白质每种微生物或多或少有其特征蛋白质，目前临床上的ELISA方法则是利用了病原微生物的这一特点[35]。利用质谱技术对培养微生物特征蛋白质的离子对进行检测，从而定性定量分析这些微生物。如结核的Antigen 85A、Antigen 85B、 Antigen 85C[36]，金黄色葡萄球菌的葡萄球菌蛋白a[37]，疯牛病的朊蛋白[38]。

3.2质谱MRM技术在病原微生物诊断中的应用MRM技术可以分析培养的微生物、血液、痰液等各种临床标本。

常规方法一般是在微生物培养后进行蛋白质抽提，用质谱进行分析。如 Kruh-Garcia等将MRM技术用于Mtb 3种重要的免疫显性蛋白质(Antigen 85A、Antigen 85B、 Antigen 85C)的检测[36]，从而达到对Mtb进行诊断的目的；Bonar等利用质谱技术对金黄色葡萄球菌的蛋白质组进行研究[37]，并根据葡萄球菌蛋白a对金黄色葡萄球菌进行诊断；Sturm等使用质谱MRM技术在亚飞摩尔水平绝对定量朊蛋白[38]。

血液是临床最常用的检测标本，开发出无需微生物培养，直接进行定量的方法是广大研究者的追求。Lange等应用MRM技术可以准确定量检测血浆中链球菌低丰度毒力因子[39]，从而达到对链球菌的鉴定。Pierce等通过噬菌体扩增技术[40]，结合MRM技术，对金黄色葡萄球菌可以进行定量检测，分析时间只需3 h，检测限达到5.0×104CFU m/L，有望用于临床疾病的诊断。Charretier等阐述了利用SRM质谱技术[41]，以金黄色葡萄球菌为例，对其各种不同肽类进行检测，其中，I肽类可以鉴定金黄色葡萄球菌到种的水平，R肽类可以检测其耐药性，V肽类对其致病因子有很好的表达，T肽类则可以区分不同的型别。Sjoholm等利用SRM技术定量分析人血浆中的M蛋白、F蛋白等[42]，从而对链球菌进行鉴定。

痰液是结核病诊断常用的标本，也有研究者正在尝试用MRM技术检测结核分枝杆菌。如Nicole等利用MRM方法分析人血清样品外泌体(exosomes)中的8个结核标志蛋白质 Antigen 85B、Antigen 85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和Mpt64[43]，从而对活动性和潜伏性结核进行鉴别诊断。Schubert等介绍了SRM不仅仅能够通过潜伏存活调节子在厌氧条件下的调节来对体外培养的结核分枝杆菌蛋白质进行鉴定和定量检测[44]，并且能够用于受感染细胞、动物模型以及临床样本(痰液等)中结核的鉴定。

3.3质谱MRM技术的局限性及展望MRM已经在基于蛋白质组学研究的生物标志物研究中呈现强大的应用前景。但是，该技术在蛋白质组学上的应用尚处初始阶段，对于MRM在小分子研究领域获得广泛应用，许多技术障碍有待攻克。MRM 技术是基于蛋白质或多肽的已知信息或假定信息进行质谱信号采集，有针对性地获取数据的方式。通过与其他质谱扫描技术的联合使用，能在蛋白质组研究中充分展现其高灵敏度、高准确性、高重复性、高通量的应用优点。可以预见，通过对MRM技术的进一步优化，未来MRM技术将更多地用于病原微生物诊断，能够更加准确、快速鉴定微生物，为临床诊断节约时间。

4　结　论

随着质谱技术的普及，越来越多的质谱技术用于微生物诊断。MADLI-TOF质谱技术具有快速、准确、灵敏、高通量等特点，同时，也存在不足之处：微生物蛋白指纹图谱数据库不够完善[45]，一些罕见菌种或新型细菌的图谱尚未被现有数据库收录，从而导致鉴定困难；含有混合菌种的血培养样本难以准确鉴别；同一菌属中相近的菌种容易错误鉴定；直接鉴定时，血培养和尿液样本中菌量对鉴定有一定的影响。MRM技术相对于MADLI-TOF质谱技术而言，准确度更高，能够特异识别各种微生物，通量大，能同时分析多个样品；但是质谱MRM技术蛋白质数据库仍然不够完善，仍需不断进行优化，以期能够适用于更多方面的研究。总之，随着质谱技术的发展，以及病原微生物数据库的完善，MALDI和MRM技术将在病原微生物鉴定方面发挥越来越大的作为，有望成为新一代病原微生物诊断的常规技术。

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Application of mass spectrometry technology in the diagnosis of pathogenic microorganism

WU Ao1,2，ZHANG Li-jun1,2

(1.ShanghaiPublicHealthClinicalCenter，FudanUniversity，Shanghai201508，China;2.WenZhouMedicalUniversity，Wenzhou325000，China)

Mass spectrometry，due to its characters of high sensitivity，specificity，automation and high throughput，etc.，has been widely applied in the studies of proteins and peptides of microorganism，and offered new technologies to diagnose pathogenic microorganism. In this manuscript，we reviewed the application of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and electrospray ionization quadrupole mass spectrometer (ESI Q MS) especially multiple reaction monitoring (MRM) technology in the diagnosis of microorganism.

MALDI-TOF; MRM technology; microorganism; diagnosis

Zhang Li-jun，Email: zhanglijun1221@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.014

张丽军，Email: zhanglijun1221@163.com

1.上海市公共卫生临床中心，上海201508；

2.温州医科大学，温州325000

R37

A

1002-2694(2016)09-0838-05

2016-02-24；

2016-04-28

“重大新药创制”科技重大专项(No.2012ZX09303013)；国家自然科学基金(No.81271834)；国家863课题(No.2014AA021403)；上海市高等级生物安全病原微生物检测专业技术服务平台(No.15DZ2290200)联合资助

Supported by the 12th Five-Year Major New Drug Discovery Science and Technology (2012ZX09303013); the National Natural Science Fund (81271834); the National 863 Project "Study the Key Technology of Personnel Protection and Lab Tracking of pathogenic microorganism" (2014AA021403); Shanghai high-grade biosafety pathogenic microorganism testing professional technical service platform (No. 15 dz2290200)