肠道微生物组及其在中药药理毒理研究中的应用

邓 红，吴纯启，江 涛，王全军

（广东药科大学1.中药学院，3.实验动物中心，广东 广州 510006；2.军事医学科学院毒物药物研究所，国家北京药物安全评价研究中心，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

肠道微生物组及其在中药药理毒理研究中的应用

邓 红1，2，吴纯启2，江 涛3，王全军2

（广东药科大学1.中药学院，3.实验动物中心，广东 广州 510006；2.军事医学科学院毒物药物研究所，国家北京药物安全评价研究中心，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

微生物组是一新兴研究领域，其研究涉及人类健康、农业、生物能源和环境等领域。其中，肠道微生物组是近年研究的热点。已有研究表明，肠道菌群与消化道疾病（炎症性肠病）、代谢性疾病（2型糖尿病）、心脑血管疾病（帕金森征）等有关。中药常作为补益药而长期大量服用，其口服进入胃肠道后，肠道菌群可影响中药药理和毒理作用。本文主要综述了微生物组的基本概况、常用的检测技术及其与何首乌所致肝毒性、黄芩直接作用于肠道、泽泻所致肾毒性及小柴胡汤所致肺炎等为代表的几种毒性作用间的关系。

微生物组；肠道；中药；药理；毒理

微生物组（microbiome）是指研究特定微生态环境样本中细菌、病毒和真菌的总和［1］。其研究领域包括生物医学、海洋、畜牧业和土壤等，对维持人类健康、畜牧业生产、环境保护等具有重要意义。微生物组是近年研究的热点之一，特别是McFall-Ngai对夏威夷短尾乌贼与其共生的发光细菌费氏弧菌间关系的研究，使得过去被认为是致病的微生物现在认为是生物体功能的一部分。McFall-Ngai也因此被称为“微生物组学研究的领航者”。

人体微生物组由微生物组与人体生存环境相结合形成，其概念于2001年提出，是指寄居在人体的全部微生物的总和［2］，可分布于人体皮肤、胃肠道和口腔等部位，不同部位栖息着不同微生物［3］，肠道菌群是其中研究较多的菌落。人体肠道中栖息着500～1000种细菌，数量达1×1014个，约为人体细胞数量的10倍［4］，其基因数（200万）约为人体基因数（2.2万）的100倍［5-6］，可参与机体信息传递、营养吸收、黏膜保护和肠道免疫等过程［4］。肠道菌落是星球上最为密集的微生态系统［7］，这些密集的微生物与机体的健康紧密相关。已有研究报道，肠道微生物与炎症性肠病、肥胖症、2型糖尿病和帕金森征［8-11］等疾病有关。此外，肠道微生物可作为人体的”代谢器官”［12］，与机体代谢密切相关，其中包括对药物的代谢，它可产生药物代谢酶参与到药物代谢过程［13］。强心剂地高辛在肠道细菌Eggertella lenta的作用下失活［14］。延胡索乙素在肠道菌群作用下迅速吸收［15］；黄芩苷被菌群转化为黄芩素而发挥作用［16］等。中药是具中国特色的民族瑰宝，几千年的临床应用验证了其在防治疾病方面的重要作用。与化学药和生物制剂相比，中药具有多靶点、毒性相对较小、作用机制复杂等特点，结合国内外文献报道发现，其药理毒理作用及作用机制可能与人体微生物组有关。因此，本文主要对微生物组的研究概况及其在中药药理和毒理研究中的应用做简要综述。

1 微生物组的研究概况

近年，微生物学科研工作者致力于研究微生物组与人体健康与疾病关系的研究。由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）在2007年投资1.73亿美元启动的研究计划——“人类微生物组计划”（Human Microbiome Project，HMP）。第一阶段（2007-2012）通过对人体常见细菌基因组进行高通量测序，确定在人体不同部位细菌的分布及多样性，利于更好地研究微生物与人体健康的关系。第二阶段在此基础上，研究已明确的不同身体部位微生物的潜在作用机制。此外，还有加拿大微生物组计划（Canadian Microbiome Initia⁃tive，MI）、欧盟人类肠道宏基因组学计划（Metage⁃nomics of Human Intestinal Tract，Meta HIT）等项目对宿主-微生物间关系进行研究［17］。此外，以McFall-Ngai和Rob Knight等为代表的个人及实验室对微生物组的研究使人们对微生物组的认识更加完善和全面。在中枢神经系统方面，Dinan等［18］研究发现，鼠李糖杆菌可通过迷走神经影响无菌小鼠的社交、记忆力和抗压能力等；在药物代谢方面，Carmody等［19］致力于研究微生物组对药物在不同病症、体质人体发生毒副作用抑或解毒作用；在皮肤免疫方面，Naik等［20］通过移植表皮葡属球菌（S.epidermidis）至无菌小鼠皮肤，发现其可修复硕大利什曼原虫（Leishmania major）导致的皮肤感染［20］；在治疗疾病方面，Petrof等［21］在实验室条件下培养合成粪便——由健康人粪便中已明确的33种细菌组成，并成功将合成粪便移植至2名艰难（难辨）梭菌感染（Closridium difficileinfection，CDI）患者体内，用于CDI治疗。此外，具有个体特异性的人体病毒组（human virome）同样影响着人体健康［22］。随着16S rRNA基因高通量测序的发展，对人体微生物组的研究日臻成熟，深入研究微生物与疾病的关系，特别是微生物在人体疾病和健康中所起作用具有重要意义。

1.1 微生物组的研究方法

对微生物组的认识可通过对其研究方法的了解。传统培养法在实验条件下只有＜1%的微生物可获得纯培养，且此法费时费力、特异性不高。目前，用于对细菌表征特性进行观察、评价微生物对抗生素的敏感性和致病性。不依赖培养的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophore⁃sis，DGGE）能全面监测微生物生态群落的动态变化，反映其多样性，但它只能显示优势菌群，并不能反映生态环境中微生物群落的真实情况［23］。

1.1.1 焦磷酸测序法

基于焦磷酸测序（pyrosequencing）原理的第2代测序平台实现了在一次实验中对来源不同的微生物进行全面、平行分析样品的微生物信息，同时为系统、准确地研究微生态环境中微生物多样性提供了全新的方式。此技术的原理是引物与模板DNA复性后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶4种酶的协同作用下，每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，最终以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列反应［24］。以焦磷酸测序平台为代表的第2代测序技术才是真正意义上实现低价大规模平行测序。Kaakoush等［25］采用焦磷酸测序技术对克罗恩病（Crohn disease，CD）患者与健康人的肠道菌群进行研究发现，拟杆菌属（Bacteroides）和变形菌纲（Proteobacteria）的比例在CD患者肠道中显著高于健康人。在CD患者的肠道中厚壁菌门（Firmicutes）显著低于健康人，这很大程度上是由梭（状芽胞杆）菌属（Clostridium）的变化引起的。有学者提出，研究肠道菌群的新思路应把菌群当作一个动态系统而非相互独立的组成菌的静止系统，这样才能明确各组成菌的作用及其间复杂的关系［24］。第二代测序技术为科研工作者在微生物组的研究提供更加全面、系统的分析，对微生物组的认识将更加全面、客观。

1.1.2 宏基因组（metagenome）技术

1998年，Handelsman等［26］提出了宏基因组的概念，也称元基因组，是指生态环境中的全部微小生物基因组的总和。宏基因组学是近年发展起来的新学科，以大规模基因组学研究作为导向，包括可培养和不可培养微生物的基因。因此，其研究在挖掘不可培养微生物的资源及筛选出新的微生物活性物质方面具有很大潜力，可通过研究微生物间的相互作用反映其内在规律。宏基因组技术对样本分析主要有以下4个步骤：样品总DNA的提取、宏基因组文库的建立、序列的测定分析和目标基因的鉴定筛选［27］。宏基因组技术的研究策略主要包括16S rRNA基因测序分析和全基因组测序分析［28-29］。前者主要是对菌群构成和物种多样性的分析，其基因由可变区和保守区组成，所有细菌共有保守区；可变区因菌种而异，具有特异性。通过对可变区或全长基因序列的分析及同源性比较，可计算出不同菌种在遗传进化的距离。全基因组测序通过对特定微生态样本总DNA进行测序，不仅能清楚微生物群落的多样性和丰度，还能挖掘出具特定功能的新基因，鉴别16S rRNA基因测序难以鉴别的菌种［2］。我国学者联合高通量测序和宏基因组学对六味地黄丸的物种成分进行系统分析，鉴别出了处方和非处方物种，并对不同药企制剂产品的一致性进行了比较分析［30］。宏基因组学可综合分析复杂微生物群体的系统和功能特性，全面了解微生物菌落的多样性和动态变化。但其未涉及正常生理条件下微生物与宿主的相互作用，因此无法推测微生物在机体生理或病理状态下的代谢过程［31］。除宏基因组学外，还有宏转录组学（metatranscrip⁃tomics）、宏蛋白组学（metaproteomics）和代谢组学（metabolomics）等组学技术应用于微生物组学的研究。

1.1.3 第三代测序技术

1.1.3.1 单分子实时（single molecule real-time，SMRT）DNA测序

SMRT DNA测序被称为第三代测序技术，是由美国太平洋生物科学公司（Pacific Bioscience）开发。它基于边合成边测序的原理，被不同色荧光标记磷酸基团的核苷酸在聚合酶活性位点上和模板结合，不同核苷酸加入配对时会发出不同光，核苷酸类型可由光的波长和峰值来判断。由于在激光照射下DNA聚合酶的活性逐渐减弱，所以合成DNA的长度有限，对酶的活性与稳定性的维持有重要意义。第一代商用的SMRT测序仪一次可同时进行大约75 000个单分子测序［32］。2013年Chen等［33］发表采用DNA聚合酶电导性的DNA测序方法。开创了单分子基因测序技术，加快了测序速度，降低了测序成本，无需添加荧光且提高了准确率。

1.1.3.2 纳米孔测序（nanopore sequencing）

纳米孔测序是由英国牛津纳米孔公司推出的技术，可直接解读DNA碱基。它以α-溶血素构建生物纳米孔，采用电泳技术，当DNA单链穿过纳米孔时，不同DNA碱基以不同方式干扰流过该孔的电流，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基而实现测序。此法最大的优势是仪器构造简单使用成本低廉、无需光学探测系统可直接测序，但其采用水解测序法，因而不能重复测序，精确度低。该公司公布了一段长度为48 000个碱基的DNA链的解读过程——是目前公布的DNA链中解读最长的一段。纳米孔测序可使测序成为常规检查，宣告了个性化医疗时代的来临［32，34］。

1.1.4 其他检测技术

基因芯片技术是指将特定探针（DNA寡糖核苷酸或DNA片段）有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品核酸杂交，最终得出遗传信息、基因序列及表达的信息等相应的生物学信息。它可对成分复杂的样品进行高通量、准确的分析，但该技术芯片特异性和信号检测灵敏度均不够高［24］。此外，还有荧光原位杂交技术和实时荧光定量PCR技术等。

微生物组的研究方法有很多，在实际应用时应根据所用样本、研究目的和研究条件等合理选择。16S测序技术的问世解决了微生物生态领域的瓶颈问题，但是它因DNA提取方法及引物选择等因素的不同，最后影响16S rRNA基因分析。第三代测序技术与第二代不同，它不依赖DNA模板PCR扩增，其测序时间更短、成本更低廉、灵活性更强、通量更高、读取长度更长、测序质量更高等优点［35］。随着微生物检测分析技术的发展，各种技术的完善将有利于科研工作者对全面了解微生物间、微生物与宿主、环境间的相互作用，揭示微生物的内在规律具有重要意义。

2 中药的毒性作用与肠道菌群间的关系

中药有效成分较复杂，主要有香豆素、黄酮、皂苷、蒽醌、生物碱和挥发油等成分。这些有效成分与肠道微生物组发生相互作用，既可增效减毒，又可减效增毒［16］。下面主要论述何首乌所致肝毒性、黄芩直接作用于肠道引发疾病、泽泻所致肾毒性、小柴胡汤所致肺炎等几种中药引起的毒性作用与肠道菌群间的关系及可能的毒性作用机制。

2.1 何首乌与肠道菌群

何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multi⁃florumThunb.）的干燥块根［36］，广泛用于临床、美容和保健产品。何首乌的不良反应在近年报道中屡见不鲜，主要为肝损伤，且伴有恶心和腹泻等症状［37-38］。二苯乙烯苷类和蒽醌类化合物是其主要的有效成分，其中蒽醌类具毒效双重性。研究表明，蒽醌类成分经肠道菌群发挥泻下作用［39］。大量长时服用何首乌致肝损伤时，蒽醌类成分可能发挥毒性作用而引发消化道疾病。肠道和肝在解剖和生理学功能上存在着紧密联系，称之为“肠肝轴”［40］，两者通过肝门静脉联系，门静脉向肝供血，肠道微生物和环境毒素等可进入门静脉［41］。肝功能障碍时，通过门静脉和肠系膜进入血液的失调微生物和内毒素增加，各种细胞因子和炎症介质被激发、释放，从而加重肝损伤，也加剧了肠道疾病［42］。胡锦华［43］对实验性急性和慢性肝损伤的肠道菌群采用实时定量PCR定量分析和传统体外培养2种方法研究发现，与空白组相比，模型组双歧杆菌属明显减少，肠杆菌属、肠球菌属和类杆菌属显著增加，且2种方法结果具有一致性。因此，何首乌导致动物肝损伤可能是通过“肠肝轴”作用于肠道菌群，菌群失调和肠功能异常又会加重肝损害，这使得肝功能异常与肠道菌群之间有相互影响、互为因果关系。

2.2 黄芩与肠道菌群

黄芩苷为苦寒中药黄芩的主要有效成分之一，具免疫调节、抑菌和抗炎等作用。黄芩苷直接作用于肠道菌群，适量可治疗病菌群紊乱，长期大量服用还可影响生理性菌群［44］。罗海燕等［45］研究发现，黄芩苷高剂量组双歧杆菌属、乳杆菌属和粪肠球菌数减少，大肠埃希菌增加；而中、低剂量组粪肠菌减少，大肠埃希菌增加。宋姗姗［46］用不同剂量的黄芩苷灌胃小鼠，低剂量组小鼠肠道菌群的多样性和丰度增高，益生菌数增多而条件致病菌数略减，能诱导形成新的更为稳定的菌落结构；而高剂量组则出现类似林可霉素所致的破坏作用，且菌落结构不稳定。含黄芩的苦寒中药复方黄连解毒汤在低剂量时对菌群无明显影响，高剂量长期服用导致乳杆菌属和双歧杆菌属等有益菌数减少，产生类似于抗生素所致的肠道菌群紊乱和肠损伤现象［47］。可见，黄芩直接作用于肠道菌群，长期大量服用易引起菌群紊乱，造成肠损伤，使肠道免疫功能下降，从而影响机体健康。对黄芩毒性的研究，有助于其在临床合理用药，减少毒副作用发生。

2.3 泽泻与肠道菌群

泽泻的单味药和复方常用于临床，六味地黄丸中含有泽泻。过去，普遍认为泽泻无毒，《神农本草经》记载：“其味甘，寒，无毒”。直至近年才发现泽泻有潜在的肾毒性［48-50］。祝建辉等［49］给予大鼠泽泻水煎液，发现对正常大鼠肾无明显影响，但可导致1/2肾切除大鼠残肾间充质炎症细胞浸润和肾小管损害。泽泻大量灌胃进入体内，使靶器官发生障碍，导致本应被重吸收的水、电解质等物质蓄积，易造成水、电解质及酸碱平衡紊乱。文献报道，晚期肾病患者和实验性尿毒症大鼠易发生肠道菌群紊乱，这些微生物移位至淋巴循环可引起微炎症反应［51］。因此，泽泻导致的肾毒性也可能与肠道菌群紊乱有关。具体泽泻致肾毒性与肠道菌群的关系尚无文献记载。目前对泽泻毒性争论很大，文献记载不同炮制工艺、机体代谢功能强弱、剂量大小、服用时间长短、配伍等因素都可影响其毒性［52］。因此，科学合理服用，同时加强对毒性的认识，可避免泽泻肾毒性的发生。

2.4 小柴胡汤与肠道菌群

小柴胡汤临床上治疗肝病疗效显著，日本广泛将其用于肝脏疾病的治疗，并报道了多起因服用小柴胡汤引起的药物性肺炎［53］。临床观察发现，小柴胡汤所致肺炎患者多为老年人且伴有肝病、免疫力低下、服药时间长达2～3个月或多年［54］。“肺与大肠相表里”学说是祖国医学相关理论的重要组成部分。该理论认为肺与大肠通过经脉联系，两者相互影响。有学者认为该理论是通过调节肠道微生态平衡而达到脏病腑治的目的。随着肺炎的发展，可破坏胃肠黏膜的屏障功能，增加其通透性，从而使肠道微生物比例失调和定位转移。临床上肺病患者多使用抗生素，易导致菌群失衡，扰乱肠道正常菌群，破坏了机体的生物屏障，使机体免疫功能下降，肠球菌属、真菌和致病菌数增加而益生菌数减少［55］。由此可见，肠道微生物可能与小柴胡汤所致肺炎有关，且此事件提醒人们中药复方在临床使用时，应根据不同病证和患者体质合理配伍，适当加减方，才能避免毒副作用的发生。

2.5 其他中药与肠道菌群

柴胡皂苷是柴胡的有效成分之一，日本大规模柴胡中毒事件［56］使人们对柴胡的毒性加深了认识，有研究报道，柴胡皂苷在肠道中经真杆菌属和双歧杆菌属水解后可生成具有活性的代谢产物，这种代谢产物可能具有毒性［57］。番泻叶在肠道细菌酶的作用下，有效成分蒽苷被还原成蒽酮或蒽酚，后者刺激肠黏膜抑制Na+的转运，从而使大肠内水分增加蠕动亢奋导致腹泻［58］。此外，四君子汤、白头翁、板蓝根和芦根等中药的药理毒理作用与肠道微生物相关。

3 展望

由于人们对中药毒性认识不足，常将其作为补益药而长期大量服用，从而引发毒性反应。常见的毒性反应为胃肠道反应、过敏反应、肝毒性和肾毒性等，传统的方法是从分子、细胞角度去研究其毒性作用机制，而对肠道菌群的研究为其提供了一种全新的方式，分子生物学技术的发展为这种研究提供了可能。本文主要简述了肠道菌群与何首乌所致肝毒性、黄芩直接作用于肠道引发疾病、泽泻所致肾毒性、小柴胡汤所致肺炎等几种中药代表所致主要脏器毒性间可能的关系。具体中药所致毒性与肠道菌群间关系鲜有文献记载，但肠道微生物组在中药药理毒理的应用具有广阔前景。

随着微生物学、分子生物学技术的发展，特别是微生物组学的发展并应用于中药学，将有利于中药加快现代化进程。肠道微生物与中药间的相互作用，决定中药是发挥治疗或毒性作用，影响着中药的药理毒理。微生物组的研究方法除了应用于中药药理毒理，在中药学其他方面的研究也发挥重要作用。李西文等［59］运用454测序技术对厚朴叶绿体进行全基因组测序，有效区分了厚朴及近源物种；白虹等［60］认为可用元基因组学方法对中药制剂的物种成分进行鉴定；李滢［61］运用454测序技术发现了甘草、丹参、蛇足石杉和龙骨马尾杉的功能基因，为实现利用生物技术生产甘草酸、丹参酮等奠定了理论基础等。这些生物技术在中药学研究的应用，将为中药学科研工作者提供全新的方式，使人们对中药的认识更加全面、科学。

目前，对微生物组的研究已成热点，肠道菌群作为人体微生物组的重要组成部分，深入研究肠道菌群与中药毒副作用间的关系对维持机体健康具有重要意义。由于绝大多数肠道微生物不能进行实验室培养，未来的研究对于寻找一种合适的培养基，模拟肠道环境培养肠道微生物具有重要的意义。对于微生物组常用的研究方法，特别是宏基因组学等组学技术在微生物领域的应用为科研工作者对肠道菌群与中药药理毒理作用关系的研究提供有利的条件。但怎样才称为正常菌群？到底是中药进入体内引发毒性反应导致菌群发生紊乱？亦或中药进入体内与肠道菌群发生相互作用而引起毒性反应？目前还无定论。中药的药理毒理作用可能是在肠道内某种特定细菌酶作用下实现的，找到这些特定酶并将其作为靶点，对于实现疾病治疗和毒性预防有重要意义。对中药毒性机制与肠道菌群间关系的研究对于全面、客观了解中药毒性具有重大意义。解决这些问题并将微生物组研究方法应用于中药药理毒理的研究，有助于认清中药的潜在毒性，加快中药现代化、国际化进程，为中药的临床应用提供更加合理、科学的依据。

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Progress in microbiome and its application to pharmacological and toxicological research of traditional Chinese materia medica

DENG Hong1，2，WU Chun-qi2，JIANG Tao3，WANG Quan-jun2
（1.School of Chinese Material Medica，3.Center of Laboratorial Animals，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，National Beijing Center for Drug Safety Evaluation and Research，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

Microbiome is a novel research field related to human health，agriculture，bio-energy and the environment.Gut microbiome has received much attention from researchers recently.Studies have shown that gut flora is related to some diseases，such as digestive disease（inflammatory bowel disease），metabolic disease（type 2 diabetes），cardie-cerebral vascular disease（Parkinson disease）. Traditional Chinese materia medica（TCMM）has long been used as a tonic and taken in a large amount.Gut flora has an effect on pharmacology and toxicology of TCMM after entering the gastroin⁃testinal tract.This article is intended to review recent researches on microbiome，common detection techniques and the relationship with hepatotoxicity induced byPolygonum multiflorumThunb.，scutel⁃laria baicalensisthat directly affects the intestinal tract，nephrotoxicity induced byRhizoma Alismatisand pneumonia induced by Xiao-Chaihu-Tang.

microbiome；gut；traditional Chinese materia medica；pharmacology；toxicology

s：WANGQuan-jun，E-mail：wangquanjunbeijing@163.com；JIANGTao，E-mail：tjiang66@21cn.com

R3285，Q939.9

A

1000-3002-（2016）09-0975-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.011

Foundation item：The project supported by National Major Scientific and Technological Special Project of China（2013ZX09302303）；National Major Scientific and Technological Special Project of China（2012ZX09301003-001-008）；and Beijing Municipal Natural Science Foundation（Z131100006513010）

2015-12-18 接受日期：2016-07-15）

（本文编辑：齐春会）

国家科技重大专项（2013ZX09302303）；国家科技重大专项（2012ZX09301003-001-008）；北京市科委基金项目（Z131100006513010）

邓 红，女，硕士研究生，主要从事：中药药效与安全性评价研究，E-mail：denghongyes@163.com

王全军，Tel：（010）66931631，E-mail：wangquan⁃junbeijing@163.com；江 涛，Tel：（020）39352996，E-mail：tjiang66@21cn.com