2015年国内外蜂产品质量安全研究进展

张文　文周金慧　金　玥　张金振　赵　文　王　琳　李　熠　赵　静（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

2015年国内外蜂产品质量安全研究进展

张文文周金慧金玥张金振赵文王琳李熠赵静
（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

本文总结了2015年国内外蜂产品质量安全研究的概况和进展，分析了本年度所有相关文献的数据库分布和研究领域分布情况。以实例的形式阐述了蜂产品中农兽药残留、重金属残留、环境激素分析、活性物质分析以及蜂蜜真实性分析的研究方法和思路。样品前处理方面，在传统的固相萃取、液相萃取和QuEChERS方法的基础上拓展出的分散微固相萃取、分散液液微萃取、快速溶剂萃取等新方法，在提取效率和环境友好等方面表现出巨大的优势；仪器方法方面，液相色谱或气相色谱串联高分辨质谱法仍然是最主流的检测方法，但是在重金属残留分析中更多采用原子吸收光谱法或者电感耦合等离子体发射光谱法。采用新的样品前处理方法提高提取效率、节约分析时间，使用高分辨质谱检测仪器提高灵敏度、实现高通量是国内外的蜂产品质量安全研究的着重点。本文的研究拓展了今后蜂产品质量安全研究的思路，同时对提升蜂产品检测方法有效性和质量控制起着积极促进作用。

蜂产品；农兽药残留；重金属残留；环境激素；活性物质分析；蜂蜜真实性分析

1　文献分布情况

2015年度截止至12月初，从美国汤姆森科技信息集团（web of science）、Google Scholar，Sciencedirect、Springerlink、EBSCO、美国分析化学协会（ACS）、英国分析化学协会（RSC）和W iley等数据库搜索结果显示，2015年大约有143篇被SCI期刊收录的与蜂产品质量安全相关的英文文献，涉及蜂蜜的有105篇、蜂王浆7篇、蜂胶23篇和蜂花粉8篇。

从中国知网、维普网、万方数据知识服务平台和国家知识产权局检索数据库的数据显示，2015年与蜂产品质量安全相关的中文学术文献约为69篇，其中与蜂蜜有关的44篇、蜂王浆5篇、蜂胶11篇、蜂蜡1篇，蜂花粉8篇，主要涉及蜂产品中的兽药和农药残留，重金属以及溯源分析。此外还包括研究专利1项和产品标准3项。

2　研究进展

2.1兽药抗生素残留分析

养蜂生产中，蜜蜂最容易得腐臭病、败血病等细菌性疾病，严重影响蜂产品的产量和质量。为了防病治病，蜂农会使用或在饲料中添加各种抗生素（氯霉素、链霉素、四环素、土霉素、金霉素和青霉素等）到蜂群中，当效果不佳而增大添加剂量时，便容易造成蜂产品抗生素残留，进而导致蓄积至一定的剂量。另外，作为花粉来源的农作物常被喷洒药物，蜜蜂外出采蜜，采集了农作物上携带药物残留的花粉和花蜜，将其携带到了蜂箱，从而也会造成蜂产品中抗生素的残留。近年来，由于新药物的开发使用，蜂产品中抗生素类药物残留的种类随之增多，因此，开发建立简单、快速，同时监测多种抗生素类药物残留的方法是今年蜂产品中兽药残留的主要着眼点。

Roberta Galarini等[1]建立液相色谱串联二级质谱的仪器方法，同时测定蜂蜜中包括磺胺类、硝基咪唑类和喹诺酮类等27种兽药抗生素残留。首先将蜂蜜样品用酸水水解，随后通过一个双纯化步骤（脱脂和强阳离子交换固相萃取）。正模式下，使用Poroshell 120 ECC18色谱柱（100~3.0 mm，2.7 mm）分离，梯度洗脱有机相为乙腈，水相为0.1%甲酸水。在0.1~10μg/kg范围内，对于所检测的27种目标化合物，该方法具有良好的选择性、线性、精确度、准确度、检出限和定量限，并且基质效应影响较小。采用该方法处理采自意大利市场74种不同蜜源的蜂蜜，在9个(12%)样品检出痕量磺胺类药物，检出量不足以危害公众安全。

祝子铜等[2]建立了快速溶剂萃取-超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定蜂花粉中氯霉素的分析方法。样品以乙酸乙酯为萃取溶剂经快速溶剂萃取，硅胶固相萃取柱净化，采用液质联用多反应监测负离子模式测定，同位素内标法定量。方法线性范围0.5~ 10 ng/m l，相关系数为R2=0.9936，回收率在88.3~ 110.0%之间，相对标准偏差在5.3~8.9%之间，检出限为0.1μg/kg。该方法具有效率高、试剂用量少、选择性好、灵敏度高等优点。

氨基糖苷类化合物(aminoglycosides)是一种广谱抗生素，对许多革兰氏阴性菌和一些革兰氏阳性菌具有抗菌活性。在兽医学和畜牧业领域，氨基糖苷类抗生素被广泛用于治疗细菌性感染，对于蜜蜂幼虫腐臭病具有很好的疗效。因此，该类药物在养蜂业被广泛应用，这样就可能导致蜂蜜中药物的残留。Wang等[3]建立利用新型聚乙烯醇固相萃取技术测定蜂蜜中氨基糖苷类兽药残留的方法。该方法回收率范围在84~112%之间，检出限为7.8~19.4 ng/ml。

2.2农药残留分析

蜂产品在生产和加工过程中受到多种农药污染的危险。首先，为避免蜜蜂幼虫大量死亡的风险，蜂农往往会对蜂巢喷洒农药预防幼虫病，氟胺氰菊酯、氟氯苯菊酯、双甲脒、溴满酯和毒蝇磷是使用最广泛的抗螨虫药。其次，田间种植的开花作物也常接受杀虫剂和除草剂处理，经蜜蜂采集后对蜂蜜、蜂花粉等造成污染。新烟碱类杀虫剂、三嗪类除草剂、有机磷农药是广泛使用在田间的农药，因此也成为科学家们关注的焦点。

新烟碱类杀虫剂源于植物源农药烟碱，是继有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂之后的第四大类杀虫剂，为一类昆虫乙酰胆碱受体激动剂。近年来，昆虫学家研究发现，新烟碱类杀虫剂与蜂群落崩溃综合症（Colony Collapse Disorder，CCD）有关。有研究表明：当蜜蜂接触新烟碱类杀虫剂时，会迷失回巢方向，蜂王繁殖能力显著下降，从而导致蜂群的数量明显减少。因此，建立蜂蜜中新烟碱类杀虫剂残留的分析方法不仅可为保证蜂蜜质量提供技术支持，也可为CCD的研究提供新的分析手段。栗有志等[4]建立了蜂蜜中吡呀酮、吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫啉、烯啶虫胺、噻虫胺、呋虫胺和氯噻啉9种新烟碱类杀虫剂的QuECh－ERS-高效液相色谱/串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。样品用纯水提取，采用N-丙基乙二胺(PSA)和酸性Al2O3净化，用Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0mm, 1.8μm)分离，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾正离子模式(ESI+)、多重反应监测(MRM)检测目标分析物，基质匹配标准溶液外标法定量。结果表明：开发方法对于9种杀虫剂均具有良好的线性关系(R2>0.9969)；方法检出限为0.3~0.8μg/kg；定量限为1.0~2.5μg/kg；在2.5、10、25μg/kg三个添加水平下，杂花蜜、油菜蜜、棉花蜜和葵花蜜四种基质样品中9种杀虫剂的平均回收率在81.7~106.7%范围内，相对标准偏差(RSDs)在4.2~9.4%之间。该方法分析速度快、灵敏度高、重现性好，适用于蜂蜜中新烟碱类杀虫剂残留的快速检测和确证。

Yuanbo Li等[5]对比了凝胶渗透色谱（GPC）和锆基萃取剂的分散固相萃取柱两种不同的提取和清理过程对于农药多残留的提取效率，前处理后采用气相色谱-四级杆质谱仪器方法测定蜂蜜、蜂花粉和蜂蜡中的11种农药，包括拟除虫菊酯杀虫剂联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯，有机磷杀虫剂毒死蜱、蝇毒磷和香豆磷，有机氯杀菌剂百菌清和三嗪除草剂阿特拉津。两种前处理方法首先用溶剂提取，随后分别采用凝胶渗透色谱（GPC）净化和含有锆基萃取剂的分散固相萃取柱净化。结果显示，GPC方法的检测限分别为：蜂蜜0.65~5.92 ng/g dw，蜂花粉0.56~6.61 ng/g dw，蜂蜡0.40~8.30 ng/g dw；固相萃取方法的检测限分别为：蜂蜜0.33~4.47 ng/g dw，蜂花粉0.42~5.37 ng/g dw，蜂蜡0.51~5.34 ng/g dw。在三种基质中，三个不同的添加浓度下，两种方法的回收率分别为64.4~149.5%和71.9~126.2%；相对标准偏差分别为1.5~25.3%和1.3~15.9%。由于锆基吸附剂是氧化锆（ZrO2）包被的二氧化硅固体颗粒，Zr原子充当电子对接受体，并且吸引脂质和色素电子基团，这种相互作用不依赖于样品提取物中的亲水基团，因此，含有锆基的固相萃取方法具有更高的灵敏度、更好的精密度以及更小的基质影响，所以更适合于蜂巢样品中目标农药，特别是百菌清的测定。

分散微固相萃取技术（dispersivemicro solid phase extraction，DMSPE）作为一种新型固相微萃取模式，具有操作简单快速高效等优点，从而受到分析工作者的高度关注。因其在萃取剂分散方式联用技术等方面的快速发展，目前已被广泛用于不同基质样品中不同目标化合物的分析。Zhang等[6]采用一种新型的基于高分子阳离子交换材料（PCX）吸附剂的分散微固相萃取法，配合超高效液相色谱串联高分辨同位素稀释质谱仪同时测定蜂蜜中的5种三嗪类农药残留。样品先用含1%甲酸的乙腈/水萃取（1∶1，v/v），然后经DMSPE过程净化。研究对影响PCX-DMSPE方法提取效率的几个重要的参数进行了优化，如吸附剂PCX用量，pH值，吸附时间，以及解吸溶剂的类型和量。在最佳工艺条件下，对于所研究的每一种化合物，该方法均呈现出良好的线性关系（r>0.999）。5种三嗪类杀虫剂的LOD为0.02~ 0.2μg/kg，回收率在89.8～116.2%的范围内。该方法相对标准偏差低于8.7%。结果表明，建立的方法有方便和高效率的优点，能够成功运用于蜂蜜样品中5种三嗪类杀虫剂的分析测定。

2.3重金属元素分析

铝、镉、钴、铜、铅、锶和锌是污染蜂产品的主要微量元素，这些重金属残留主要是在生产、运输、储存过程中带入的。其主要来源包括：农用化学物质的使用、工业三废的污染；蜂产品生产、加工过程使用不符合卫生要求的机械，在运输过程中的管道和容器等含有毒金属；以及植物在生长过程中从土壤中吸取了重金属。包括火焰原子吸收光谱法和石墨炉原子吸收光谱法在内的原子吸收光谱法，在蜂产品中重金属含量测定中应用较多，技术较成熟，主要用于测定中药材中Pb、Cd、As和Cu的含量，具有检出限低，准确度高，选择性高，谱线较简单，谱线干扰少，分析速度快等优点；但是，原子吸收光谱法等只能单个元素逐一测定，而电感耦合等离子体外发射光谱(ICP-OES，又称ICP-AES)法可在适当的条件下同时测定，具有灵敏度高、检测限低、精密度高、线性范围宽及抗干扰能力强等特点，能将多种金属元素同时或按顺序测定，测定速度快，近年来在蜂产品中重金属元素分析中得到较广泛应用。

Francisco C.Rosa等[7]采用液液微萃取和火焰原子吸收光谱法测定蜂蜜中的镉和铅。研究中对分散溶剂的种类和体积参数（300μl乙腈溶镉和900μL丙酮溶铅），类型和萃取剂（140μl四氯化碳）的体积，络合剂浓度（对Cd和Pb的钠二乙基浓度分别为0.25 g/l和0.50 g/l），pH值（7.0），温度（35℃），提取物的洗涤循环（2次），离心速度（镉840 r/min，铅4600 r/min）和样本质量（500mg）进行了优化和评价。Cd和Pb的方法检出限分别为20 ng/g和140 ng/g。检出限低于欧盟制定的食品中Cd和Pb的限量（500 ng/g）。因此，该方法完全可以用于蜂蜜中镉和铅的常规分析和质量控制。Andreia Santos do Nascimento[8]用差分脉冲阳极溶出伏安法（DPASV）测定无刺蜂蜂蜜中微量元素镉，铜，铅和锌的含量。结果显示，铅在所有样品中均存在，铜和锌的检出率为98.15%，Cd的检出率仅为33.33%。

HasanMohammadiAghamirlou等[9]将蜂蜜样品由硝酸和过氧化氢在微波炉内消化，然后使用电感耦合等离子体-发射光谱法（ICP-OES）进行分析。结果显示，不同地区蜂蜜样品中镉、锌、镍和铬的含量没有显著差异（P>0.05），其中锌是蜂蜜中含量最丰富的金属（1481.64μg/kg）。在工业比较发达的东部地区，各种金属的含量相对较高，其中铅在东部地区的水平最高为935.48μg/kg，在南方地区最低为205.40μg/kg。与适用于食品中的限量相比，铅的含量相对较高，而镉的含量相对较低。

2.4蜂蜜真实性分析

蜂蜜掺假是指将糖浆类物质或者品质不好的劣质蜜加入到蜂蜜当中，再以天然蜂蜜的形式出售，主要类型有蔗糖和麦芽糖浆掺假、饴糖和麦芽糖浆掺假、玉米和蔗糖高果糖浆掺假、大米和甜菜糖浆掺假、品种掺假以及混合糖浆掺假六种。蜂蜜糖浆掺假是一个普遍存在的问题，并且多种类型的糖浆同时用于蜂蜜掺假中的现象愈发严重，并且没有可同时检测到所有这些掺杂物的可利用的方法，辨别色谱方法中的特征峰和核磁共振氢谱中的特殊结构，找到多种方法同时掺假的特征标记物是鉴定蜂蜜真实性的重要研究思路。

（未完待续）

支持项目：国家蜂产业技术体系建设专项资金资助（CARS-45）和国家自然科学基金（Project No.31201859）

赵静，研究员，从事蜂产品质量安全研究与评价工作，E-mail:zhaojingjun@sina.com。