微小RNA在骨质疏松症治疗中的作用及机制的研究进展

陈煦 王新力 邹远康 李天, 2 * 赵雄*

1. 第四军医大学西京医院骨科，西安 710032 2. 第四军医大学生物医学工程学院，西安 710032

骨质疏松症的严重性仅次于心脑血管疾病和肿瘤。国内骨质疏松症总患病率为12.4%，老年人患病比例超过一半以上，其中，并发骨折发生率接近33%。微小RNA(miRNA)是一种广泛存在于真核生物中，影响细胞增殖、分化、凋亡的重要分子，在肿瘤预后与基因治疗、自身免疫疾病中的功能研究、心血管系统疾病及内分泌系统疾病诊疗上有广泛的应用前景。在骨分化与骨再生过程中，miRNA的异常表达与骨质疏松发生的关系尤为密切，成为当今的研究热点之一。本文将对miRNA与骨分化和骨再生相关机制做一综述，旨在为骨质疏松症的临床治疗提供参考。

1 miRNA调节骨分化

miRNA是一类广泛存在于生物基因组中，由内含子和编码基因间隔区基因编码、长度在20～22 nt的单链小分子RNA。miRNA5′端2到8位核苷酸可通过碱基互补配对靶向结合mRNA3′端多个非翻译位点，进而发挥其生物学作用[1]。 目前，关于miRNA表达谱的分析方法有多种，如锁核酸探针PCR，高通量测序技术和微阵列分析[2]。相关研究发现，Runx2和其下游分子Osterix是调节成骨细胞分化重要的特异性转录因子，也是miRNA作用的主要靶点，miRNA通过与它们相互作用激活或抑制骨的分化。

1.1 miRNA调控Runx2信号通路

Runx2即核心结合因子α1(core-binding factor alpha1，Cbfa1)，是对成骨细胞分化和骨质形成有重要影响的特异性转录因子。Runx2可促进成骨基因的表达，包括骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、I型胶原(collagen-1，ColI)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等，进而发挥相应的生物学效应。研究发现，65%～80%锁骨或颅骨发育不全的人存在不同程度的Runx2突变[3]，Runx2基因敲除小鼠成骨细胞发育受阻，骨骼发育不良或缺如[4]。这些表明Runx2参与骨代谢的一些信号通路，在骨生长发育过程中具有重要作用。

miRNA可以直接与Runx2相互作用调控Runx2表达。研究发现，miR-133可以靶向结合Runx2的 mRNA，抑制小鼠C2C12细胞向成骨细胞的分化[5]。在小鼠骨髓间充质干细胞中，miR-338-3p可直接作用于Runx2和成纤维细胞的生长因子2型受体(Fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)，引起骨质疏松[6]。Jeong等[7]研究发现，雌激素受体相关受体γ(estrogen-related receptor γ，ERR γ)可通过下调Runx2在前成骨细胞的表达活性，抑制成骨细胞分化。其后续实验也表明，ERR γ通过诱导小鼠C3H10T1/2细胞miR-433表达，在转录后水平直接调控Runx2，抑制骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)的表达。另有研究[8]表明，Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1， Smurf1)可通过蛋白酶体途径降解Runx2，而miR-15b能通过减少骨髓间充质干细胞中Smurf1的表达间接上调Runx2的水平。因此，Runx2作为骨质疏松的信号通路中的关键分子，可以与许多上下游分子相互作用，通过“串话(crosstalk)”作用影响骨的生长发育。

1.2 miRNA调控Osterix信号通路

Osterix(OSX)又称SP7，是一个含有锌指结构的重要转录因子，属Kruppel样家族的SP亚群，其基因敲除小鼠可因骨矿化异常在出生后迅速死亡。研究[9]发现，在原代培养的小鼠成骨细胞中，miR-93过表达可作用于OSX基因，抑制骨矿化过程。据Li等[10]报道，miR-143作为多种肿瘤如非小细胞肺癌、胰腺癌和乳腺癌的抑制剂，可通过减少OSX的表达抑制MC3T3-E1向成骨细胞分化。

miRNA主要作用于OSX基因或OSX mRNA来发挥负调控作用。近期研究[11]表明，miR-145通过减少OSX的表达，抑制C2C12和MC3T3-E1细胞的成骨分化。另一项研究[12]用BMP诱导成骨细胞分化，发现C2C12细胞内的miR-214作为OSX抑制物参与了此过程的调控。此外，MiR-31可降低OSX mRNA的表达，抑制人骨髓间充质干细胞的成骨发育[13]。与其类似的一项研究[14]显示，通过上调miR-125b表达和下调OSX表达可抑制骨髓间充质干细胞的增殖与分化。另有研究[15]发现，miR-31，miR-142和miR-138均表现出抑制OSX的表达，而miR-322明显上调OSX水平。

1.3 miRNA与骨代谢信号间通路之的相互作用

Runx2和OSX的许多上游或下游分子也参与骨分化与代谢，骨的分化与代谢正是这些调控分子与信号通路的协同作用下完成的，即“串话”作用(crosstalk)。BMP是一种属于TGF-β家族的多功能的生长因子，可通过Smad依赖的BMP信号通路刺激间充质骨成熟，是一种受Runx2调节的成骨诱导剂[16]。BMP信号可通过Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶细胞膜受体特异性激活Smad-1，- 5，- 8，并与Smad-4形成配合物，激活转录过程[17]。Li等研究表明，在MC3T3细胞中，miR-29b通过抑制TGF-β3以及激活素II型受体(activin receptor 2A，ACVR2A，TGF-β超家族的另一成员)维持Runx2等一些重要转录因子的正常水平。此外，一些其他经典的Wnt信号通路，如MiR-335-5p通过激活Wnt /β-catenin，促进糖原合成酶激酶-3 (glycogen synthase kinase 3，GSK-3)的磷酸化，增强β-catenin转录信号，并通过下调Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-related protein-1，DKK1)促进小鼠C3H10T1 / 2细胞的成骨分化[18]。除了BMP、TGFβ和Wnt信号转导，一些其他信号通路，如MAPK信号、Notch信号通路、Hedgehog信号通路、nell-1信号通路、 IGF信号与氧化应激信号通路也在其中发挥着重要作用，有待进一步深入研究。

2 miRNA调节骨再生

2.1 寻找合适的再生前体——间充质干细胞

骨骼发育涉及整个生命过程，包括骨的生长，再生和重塑。骨质疏松和骨损伤会导致骨强度的减弱，从而增加骨折的风险。对于骨质疏松及骨折患者的骨修复，目前研究的首要突破是找到了合适的再生前体：间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。间充质干细胞是骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪等间充质组织的再生基础。实验表明，移植后的MSCs可产生胚胎发育中神经外胚层起源的细胞，如骨骼肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管上皮细胞等[19]。骨组织的形成始于骨髓基质干细胞的生长，后者可分化为成骨细胞的前体，再逐渐发育成熟。在这一发育过程中，均可检测到miRNA在其中发挥的重要调节作用[20]。此外，基因和 miRNA的表达的检测技术使我们能够揭示特定miRNA调控骨髓间充质干细胞向不同细胞的分化过程，如miR-96、miR-124、miR-199a可诱导成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞不同的分化去向[21]。研究也发现，各种miRNA水平在未分化的间充质干细胞和分化的骨细胞之间具有差异，如miR-30c、miR-15b和miR-130b在成骨细胞中过表达，其水平明显高于未分化的间充质干细胞[22]。

2.2 探索调节的关键靶点——目标基因

骨重建的关键是识别miRNA的靶基因。有关靶基因预测的生物信息学技术产品如pictar-4，5和荧光素酶等检测技术，可为miRNA靶基因的检测提供帮助[23]。一方面，经典的骨转录元件如Satb2的抑制分子miR-34b和miR-34c在小鼠主要的成骨细胞中可同时被检测到[24]。另一方面，许多新的或易被忽视的靶基因如PPAR γ 可被miR-20a和mir-548d-5p抑制。而miR-20a的过表达，会导致Bambi和Crim1基因沉默，无法发挥正常的生物学功能[25]。值得注意的是，除了3′UTR区，miRNA可能在许多天然靶基因的氨基酸编码序列中发挥生物学功能。刘等[26]发现，CDS和3′UTR等靶向目标能有效地被miR-15a / miR-16和miR-92a抑制。Tay等[27]研究发现：miR-134能靶向结合性别决定区Y相关的HMG盒2，miR-296能靶向结合基因的同源异型盒和miR-470能特异结合八聚体结合转录因子4(Oct4，也称POU结构域第5类转录因子1)。这些miRNA均作用于编码区，共同促进维甲酸对小鼠胚胎干细胞的诱导分化作用。此外，除了转录后控制的mRNAs，miR-2861已被证实结合HDAC5 mRNA的CDS，而miR-3960已被证实能与Hoxa2 mRNA CDS相互作用[28]，且miR-93表达对Osterix mRNA的CDS抑制性效果也通过荧光素酶报告基因分析得以验证[29]。

2.3 控制细微的调节过程——诱导阻遏因子

鉴于目前已有的发现，通过影响骨相关的miRNA的表达水平能够调节骨修复和再生。进一步的研究方向应该集中在如何通过调控miRNA在基因水平的表达作用来影响骨骼发育。通常采用的方法是使用抗miRNA的分子阻碍这些目标蛋白编码基因的启动子，抑制那些靶向蛋白编码基因的表达[30]。目前，一类新构建的化学修饰、胆固醇结合的单链RNA类似物可用于结合互补的miRNA。Ebert和他的同事发明了一种新型miRNA抑制剂，可在哺乳动物细胞中表达，他们称之为“miRNA海绵”[31]。Qureshi等[32]使用了一个银纳米粒子复合物光活化miR-148b模拟传递，成功诱导细胞成骨分化。另一项研究[33]发现，细胞穿透性肽(cell penetrating peptides，CPP)富含精氨酸，可通过介导 miR-29b在细胞内作用，促进hMSCs向成骨细胞分化。这些成果的发现为骨质疏松及骨折等多种复杂疾病的修复治疗带来了前景，将成为未来研究靶向药物治疗的研究热点。

3 述评

综上所述，骨质疏松症是一种病因复杂，治疗困难的疾病；其分子机制涉及遗传基因、信号通路、激素及旁分泌因子等。目前研究试图通过影响miRNA调节骨分化的过程实现骨再生的方案主要存在两方面的问题，其一是虽然在miRNA调节骨分化的机制方面已取得一定进展，发现了与成骨细胞分化相关的信号网络，但骨质疏松的发病与破骨细胞功能亢进，骨代谢不平衡等多种因素有关。在这些异常生理现象中，关于miRNA具体机制的研究为数不多，有待进一步探究。可喜的是，近期低氧诱导因子、血小板源生长因子、蛋白激酶B、局部粘着斑激酶等新的信号通路的发现，为我们寻求miRNA在骨质疏松治疗上提供了新的路径，如目前新发现的miR-214就是通过调控Akt通路来影响骨代谢过程[34]。其二是在干细胞的骨再生领域，以miRNA为基础的骨骼再生是否能应用于体内骨再生。miRNA这种新兴疗法可能存在很多潜在的安全性问题。由于每个细胞的miRNA都能够调控上百种基因的表达，因此miRNA途径的微小失调也会对骨骼造成非常严重的后果。目前miRNA的在临床应用遇到的瓶颈是给药途径、给药浓度上的问题。虽然Eskildsen 等[35]在构建的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型中发现羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)与anti-mir-138分子填充骨髓间充质干细胞可以促进骨形成。但这种模拟或干扰miRNA研究多基于细胞株及动物实验，所用的miRNA浓度并非正常生理条件下的人体内的miRNA浓度，所以其具体相关性功能还需进一步验证。