己酮可可碱对老年雄性大鼠梗死心肌的保护作用及机制

简立国　李小威　丁同斌　刘士超

(郑州大学第二附属医院心内科,河南　郑州　450014)



己酮可可碱对老年雄性大鼠梗死心肌的保护作用及机制

简立国李小威丁同斌刘士超

(郑州大学第二附属医院心内科,河南郑州450014)

〔摘要〕目的观察己酮可可碱对老年雄性大鼠心肌梗死后梗死面积、心功能及基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白在心肌中表达的影响。方法45只老年雄性Wistar大鼠，随机分为假手术组、模型组、治疗组，每组15只。假手术组,开胸暴露心脏，只穿线而不结扎左冠状动脉前降支，模型组和治疗组分别结扎左冠状动脉前降支。治疗组术后即刻及术后每天腹腔注射己酮可可碱，假手术组和模型组注射等剂量生理盐水。术后7 d分别取材，进行心肌梗死面积测定、通过小动物多道生理记录仪和超声心动图检测心功能、免疫组化法观察MMP-9的蛋白表达情况。结果治疗组心肌梗死面积缩小、心功能改善明显；与假手术组相比，模型组和治疗组MMP-9蛋白表达显著升高；治疗组MMP-9蛋白表达水平低于模型组。结论己酮可可碱对老年大鼠缺血心肌具有保护作用，其机制可能是减少MMP-9蛋白的表达。

〔关键词〕己酮可可碱；心肌梗死；基质金属蛋白-9

第一作者：简立国(1971-)，男，教授，硕士生导师，主要从事心血管疾病基础与介入治疗研究。

急性心肌梗死(AMI)是临床常见的急危重疾病，其中炎症反应在其发生发展过程中扮演重要角色，肿瘤坏死因子(TNF)-α是炎症反应中的重要始动因子。研究表明TNF-α可激活c-Jun和c-fos基因，后者与基质金属蛋白酶(MMP)-9启动子区的活化蛋白(AP)-1结合，导致MMP-9激活〔1〕，MMP-9参与心肌缺血、心肌重塑、心力衰竭等多种心血管疾病的病理生理过程〔2〕，己酮可可碱是一种能够抑制TNF-α转录和翻译的黄嘌呤衍生药物。基于上述报道，笔者提出如下假设，己酮可可碱对缺血心肌有保护作用，其机制可能为抑制MMP-9蛋白的表达，从而减少心肌重塑、心肌坏死。本实验通过观察己酮可可碱对老年大鼠心肌梗死后梗死面积、心功能及MMP-9蛋白在心肌中表达水平的作用，探讨其心肌保护机制。

1材料与方法

1.1药物、主要试剂及实验器材己酮可可碱注射液(石家庄第一制药厂)，MMP-9兔Ig-G单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，SP免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，Biopac多道生理记录仪(美国BIOPAC公司)，GE VIVID7超声诊断仪(美国GE公司)，小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸设备公司)，显微镜(奥林巴斯公司)，MFLLab200心功能软件记录仪。

1.2动物造模及分组老年雄性Wistar大鼠45只(郑州大学动物中心提供，合格证号：410116)，体重(510±35)g，平均月龄(18±0.2)个月，随机分为假手术组(开胸，只穿针而不结扎左冠状动脉前降支)、模型组、治疗组，每组15只；参考文献〔3〕方法，质量分数10%的水合氯醛腹腔麻醉后，常规背位固定，连接多通道生理信号采集处理系统，气管插管后连接呼吸机。左前胸常规备皮、消毒，心搏最明显处剪开皮肤开胸暴露心脏，切开心包，在动脉圆锥与左心耳之间下约1 mm处用线结扎左冠状动脉前降支，观测前壁心肌组织颜色由鲜红迅速变为暗红，随后逐渐变为白色，心电图监测Ⅰ和avL导联ST段较前上抬>0.2 mV提示手术成功。心脏重置于胸腔，分层缝合胸壁。治疗组术后即刻及术后每天腹腔注射己酮可可碱(200 mg/kg)，假手术组和模型组注射等剂量生理盐水。

1.3超声心动图检测心功能术后7 d对各组大鼠进行心功能检查，选取一幅标准心尖四腔切面，进入Simpson法研究模式，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)，计算出射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)，各指标均测量2次，取平均值。

1.4血流动力学测定术后7 d，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠。麻醉成功后分离右侧颈总动脉，插入测压导管，连接Biopac多通道生理记录仪，将导管插入左心室，记录左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩末压(LVSP)、左心室上升下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.5梗死面积测定术后7 d处死大鼠，40%甲醛灌流固定后取出心脏，沿左室短轴横切片，常规脱水、透明、包埋、切片、HE染色光镜下观察，IMS图像分析系统检测心肌梗死面积和左室心肌面积，梗死面积百分比(%)用心肌梗死面积/左室面积×100%表示。

1.6心肌免疫组织化学染色术后7 d大鼠心肌MMP-9的检测采用SP二步法进行免疫组织化学染色，具体步骤按试剂盒说明书操作。抗体稀释浓度1∶100，阴性对照用PBS替代一抗。每张切片任选5个视野，细胞质、细胞膜、间质中出现棕黄色颗粒，且其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。免疫组化染色的半定量判定：①蛋白染色指数，染色强度：无色、淡黄、棕黄、棕褐分别为0、1、2、3分；染色广度：阳性细胞占总细胞的百分比；免疫组化染色指数为染色强度与染色广度乘积，指数越高，蛋白表达越多。②采用图像分析系统进行图片处理，用积分光密度(IOD)表示MMP-9蛋白的表达，IOD=面积密度×平均光密度，IOD数值越大，表示蛋白表达越强。

1.7统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。

2结果

2.1己酮可可碱对老年大鼠超声心动图心功能结果的影响心肌梗死后LVEDD及LVESD较假手术组显著增加，而EF及FS则显著降低，与模型组比较治疗组LVEDD及LVESD显著降低，而EF及FS则显著升高，见表1。

2.2己酮可可碱对心肌梗死大鼠血流动力学影响心肌梗死后LVSP及LVEDP显著升高，±dp/dtmax显著降低；与模型组相比，治疗组LVSP升高明显，提示己酮可可碱能增强心肌收缩，而LVEDP升高及±dp/dtmax显著降低则提示己酮可可碱能增加心肌舒张功能，见表2。

2.3己酮可可碱对大鼠梗死面积的影响治疗组心肌梗死面积较模型组显著减少，说明己酮可可碱能够缩小心肌梗死范围。见表2。

表1　各组大鼠超声心动图心功能检查结果

与假手术组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05，下表同

表2　各组大鼠有创血流动力学及梗死

2.4己酮可可碱对梗死大鼠心肌MMP-9蛋白表达的影响应用免疫组织化学染色显示，与假手术组〔(0.132±0.008)〕比较，MMP-9表达量在模型组细胞质明显升高可见大量强阳性棕褐色颗粒〔(0.537±0.012)，P<0.05〕，而假手术组MMP-9表达量极低，几乎见不到棕褐色颗粒。与模型组比较，治疗组MMP-9表达量显著减少〔(0.408±0.009)，P<0.05〕，见图1。

图1　已酮可可碱对梗死心肌组织MMP-9蛋白表达的影响(SP，×400)

3讨论

AMI是冠状动脉急性、持续缺血缺氧所引起的心肌坏死，是一种心血管急危重病，临床预后与心肌梗死范围及时间密切相关，其中以左前降支闭塞导致的心梗后左心室衰竭预后最差，因此如何减少心梗后心衰成为目前医学研究热点。Irwin等〔4〕研究发现心肌梗死后大鼠心肌TNF-α mRNA表达量明显增加，同时TNF-α与心肌缺血严重程度有关。临床研究表明己酮可可碱可改善心力衰竭患者的NYHA分级和左室射血分数(LVEF)〔5〕。不论缺血性还是非缺血性心肌病患者，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和β受体阻断剂是否达到最优化治疗，不同NYHA心功能分级的心力衰竭患者均可从己酮可可碱治疗中获益。本研究发现，己酮可可碱可逆转心肌缺血引起的血流动力学改变，改善左室功能。

心力衰竭是各种心脏病的终末阶段，其病理生理机制主要是神经内分泌的激活和心室重构，其中心室重构重要环节是心肌细胞的重塑和心肌细胞外基质的变化。由基底膜蛋白、纤维胶原、糖胺聚糖和蛋白多糖等组成的心肌细胞外基质(ECM)对维持心脏形状和功能起重要作用，MMPs能降解ECM，MMP-9又称明胶酶B，是MMPs家族重要成员之一，与多种心血管疾病密切相关。心力衰竭时，MMP-9被激活，胶原结构遭到破坏进而导致心肌间连接趋于松散，在室壁压力的作用下，左心室构形出现变化，进而导致室壁抗张力作用明显下降，加重左室形态和大小的改变，进而影响左心室功能，由此看出，MMP-9在心室重构中扮演重要角色。研究表明，利用MMP-9抑制剂可延缓慢性心力衰竭犬左心功能障碍和重构的发生〔6〕。Yan等〔7〕研究184例EF<40%的患者，发现血浆MMP-9升高与EF降低，LVEDD增加及左室功能下降有良好的相关性，因此降低MMP-9表达水平可改善左心功能。本研究发现，己酮可可碱可改善心肌梗死后大鼠左心功能，可能与其减少大鼠心肌MMP-9蛋白的表达水平有关。

易损斑块的纤维帽破裂和局部血栓形成是心肌梗死的主要发病机制。研究表明MMP-9在降解ECM、使斑块纤维帽崩解及随后的斑块破裂起重要作用〔8〕。Manginas等〔9〕发现心肌梗死患者外周静脉血MMP-9水平明显升高，且与肌钙蛋白I存在相关性。Fiotti等〔10〕通过收集支架植入术中患者远端保护装置中的碎屑发现，MMP-9在急性冠脉综合征组的表达高于稳定型心绞痛组。因此MMP-9除了与心肌梗死直接相关外，还能反应疾病严重程度。本研究发现，心肌梗死后大鼠心肌中MMP-9蛋白表达增加，这与上述报道一致，己酮可可碱可减少心梗面积，可能与其降低MMP-9蛋白的表达有关。

综上所述，己酮可可碱对老年大鼠心肌缺血有保护作用，同时可改善心肌梗死后左心功能，这可能与其抑制MMP-9蛋白表达有关。

4参考文献

1Suh SJ,Kim JR,Jin UH,etal.Deoxypodophyllotoxin,flavolignan,from Anthriscus sylvestris Hoffm.inhibits migration and MMP-9 via MAPK pathways in TNF-alpha-induced HASMC〔J〕.Vasc Pharmacol,2009;51(1):13-20.

2Ruter JL,Barnett BG,Kryczek I,etal.Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy:a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines〔J〕.Front Biosci,2009;14:1761-70.

3Drexler H,Depenbusch JW,Truog AG,etal.Effects of diltiazem on cardiac function and regional blood flow at rest and during exercise in a conscious rat preparation of chronic heart failure (myocardial infarction)〔J〕.Circulation,1985;71(6):1262-70.

4Irwin MW,Mak S,Mann DL,etal.Tissue expression and immunolocalization of tumor necrosis factor-alpha in postinfarction dysfunctional myocardium〔J〕.Circulation,1999;99(11):1492-8.

5Sliwa K,Woodiwiss A,Kone VN,etal.Therapy of ischemic cardiomyopathy with the immunomodulating agent pentoxifylline:results of a randomized study〔J〕.Circulation,2004;109(6):750-5.

6Morita H,Khanal S,Rastogi S,etal.Selective matrix metalloproteinase inhibition attenuates progression of left ventricular dysfunction and remodeling in dogs with chronic heart failure〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006;290(6):p522-7.

7Yan AT,Yan RT,Spinale FG,etal.Plasma matrix metalloproteinase-9 level is correlated with left ventricular volumes and ejection fraction in patients with heart failure〔J〕.J Card Fail,2006;12(7):514-9.

8Johnson JL.Matrix metalloproteinases:influence on smooth muscle cells and atherosclerotic plaque stability〔J〕.Exp Rev Cardiovasc Ther,2007;5(2):265-82.

9Manginas A,Bei E,Chaidaroglou A,etal.Peripheral levels of matrix met alloproteinase-9,interleukin-6 and C-reactive protein are elevated in patients with acute coronary syndromes:correlations with serum troponin I〔J〕.Clin Cardiol,2005;28(4):182-6.

10Fiotti N,Altamura N,Orlando C,etal.Metalloproteinases-2,-9 and TIMP-1 expression in stable and unstable coronary plaques undergoing PCI〔J〕.Int J Cardiol,2008;127(3):350-7.

〔2015-03-17修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

通讯作者：刘士超(1986-)，男，住院医师，主要从事心血管疾病基础与临床研究。

〔中图分类号〕R541.4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6356-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.017