蛋白质组学在中医药科学研究中的应用进展△

朱宇伟，于庆云，刘培，张卫华，于金高，李会伟，张颖，朱悦

(1.南京中医药大学 江苏省方剂高技术研究重点实验室/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学 基础医学院，江苏 南京 210023)

·综述·

蛋白质组学在中医药科学研究中的应用进展△

朱宇伟1，2，于庆云1，2，刘培1*，张卫华2，于金高1，李会伟1，张颖1，朱悦1

(1.南京中医药大学 江苏省方剂高技术研究重点实验室/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学 基础医学院，江苏 南京 210023)

蛋白质组学是以生物体的全部或部分蛋白为研究对象，研究其在生命活动过程中的作用和功能。近年来，蛋白质组学在中医药现代研究中的应用越来越广泛，本文对蛋白质组学在中医药若干科学问题研究中的应用现状，包括中药材栽培、中药作用靶点、中医证候本质及对方剂作用机理等方面进行分析与论述，以期为蛋白质组学进一步应用于中医药研究提供参考。

蛋白质组学；中医药研究；应用进展

蛋白质组学(proteomics)是指通过生化方法对蛋白质进行大规模研究的科学，其与转录组学、基因组学和代谢组学等一同构成系统生物学的组学(omics)生物技术基础。随着人类基因组测序计划的完成，单纯的基因组研究已经满足不了科研的需求，生命科学的重心开始转移到对基因的表达产物蛋白质的研究上来。中医药是中华民族的瑰宝，是中华医学文化几千年临床经验的积淀。蛋白质组学可以作为连接中医药与现代医药两种科学体系的桥梁，为中医药认识疾病的方法、理论的现代科学表征体系提供适宜的方法。

随着科技的发展，蛋白质组学具有整体性和系统性[1]的特点，随着科技的发展，蛋白质组学在中医药科学研究中的应用越来越多，其应用范围从药材的种植、性状研究，到中药作用机制的探讨，再到中医基本理论的量化、方剂临床疗效的分析等方面。

1 蛋白质组学在中药材栽培研究中的应用

植物从生长发育到衰老死亡，体内的蛋白质将发生相应的改变，通过研究植物的蛋白质组学，可以发现相关的反应蛋白，进而指导植物的栽培。近年来，国际上越来越多地利用蛋白质组学技术研究植物组织(器官)、细胞器、植物发育过程和植物响应环境胁迫的蛋白质组特征等方面内容。

在中药材栽培上，李改玲[2]对地黄连作障碍的差异蛋白质组学进行研究，发现不同连作条件下37个发生差异表达的蛋白质，并鉴定了其中与光合作用、代谢、能量、抗性、细胞分裂相关的31个蛋白质。林茂兹等[3]采用差异蛋白质组学方法研究连作、轮作下太子参叶片蛋白质的差异表达，结果发现，连作可导致叶片中与植物衰老或病害、植物抗性相关的蛋白表达量上调，初步解释了太子参连作病害频发和提前退黄的分子基础。Prinsi等[4]利用蛋白质组学的技术发现，两个品种(软溶质和硬溶质)的桃果实在跃变前后有53个蛋白差异表达，其中1-氨基环丙烷基-1-羟酸(ACC)氧化酶在桃果实跃变前后变化最为显著，其次是腺苷甲硫氨酸合成酶和β-氰丙氨酸合成酶。这3种酶都参与了乙烯的生物合成和代谢，在果实成熟过程中发挥着重要作用。Dong等[5]发现，在成熟过程中蛋白质组学多态性在毛毛虫体内和冬虫夏草基质中呈动态变化。毛孢(HS)和蝙蝠蛾拟青霉(PH)蛋白质组学多态性与冬虫夏草不同，这表明，在成熟过程中与冬虫夏草相关的真菌和多种冬虫夏草基因型存在差异蛋白表达。章燕珍[6]应用紫外线B波(UV-B)诱导技术对活体阔叶十大功劳叶进行紫外诱导及相关蛋白质组学分析。通过对6 h UV-B照射、不同时间培养后的指纹图谱进行分析，发现阔叶十大功劳中次生代谢产物有显著的变化。与对照组相比，药根碱、非洲防己碱、巴马汀和小檗碱分别增加了919.6%、391.4%、192.4%和33.1%。通过基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)鉴定，普通双向电泳得到了13个差异点，利用组合肽配体库技术后，检测到了91个新蛋白点，同时异喹啉生物碱合成的6个关键酶基因经诱导后也显著提高。

植物各组织(器官)和细胞器中的许多蛋白在植物生长发育过程中发生变化。大部分中药材中含有与光合作用、代谢、细胞分裂、成熟相关的蛋白质。通过对这些蛋白质的比较研究，可掌握药用资源生物生长成熟过程中与可利用物质相关的蛋白质的变化规律，可为从分子水平对药用资源生物可利用物质生物合成进行定向调控提供依据。

2 蛋白质组学在中药作用靶点研究中的应用

中药进入体内发挥作用的基本环节是药物分子与细胞之间的直接或间接的相互作用，而这必然会引起从遗传信息到整体功能实现中的分子、细胞、器官、整体多个层面的结构与功能状态的改变，调节这些层面的结构与功能的本质是基因，而直接的作用者主要是蛋白质。通过蛋白质组学分析可以进行中药材有效部位或有效成分作用靶点的识别，进而指导和预见中药材中化学成分的发现和分离[5-7]。

Yue QX等[8]用蛋白质双向电泳结合基质辅助激光解吸电离质谱与电喷雾质谱(MALDI-MS/MS)鉴定的方法研究灵芝中的灵芝酸D(Ganoderic acid D)对人宫颈癌细胞株Hela细胞毒性的作用机制，发现了21个可能是灵芝酸D靶点的差异表达蛋白，并绘制了这些蛋白的相互作用网络。Wang X等[9]利用蛋白质组学方法发现，从藤黄中分离的S型藤黄酸(S-gambogic acid)抑制人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的蛋白质分子靶标为stathmin 1。赵欣等[10]应用二维电泳与质谱联用技术，在帕金森病小鼠模型上对中药成分松果菊苷的神经保护作用机制进行研究，发现胆绿素还原酶B可能为其作用过程中的关键蛋白之一。Liu等[11]采用蛋白质组学技术考察了丹参酮IIA保护阿霉素造成的小鼠肾损伤的分子机制。张李峰[12]在红芪和黄芪的免疫调节作用及抗免疫老化机制比较硏究中，通过蛋白质组学技术扫描得到蛋白质图谱，并进行质谱鉴定，分析差异蛋白质。结果发现，老龄小鼠脾淋巴细胞总蛋白图谱经含红芪或含黄芪玉屏风含药血清干预后发生明显变化。根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)蛋白质数据库中提供的功能信息，成功鉴定了9个蛋白质，实验结果初步证明，这些蛋白可能与衰老有关。Lin等[13]在系统生物学文献回顾研究中发现，许多研究都表明针灸和草药具有治疗价值。不同的穴位、不同的治疗时间和草药提取物可用于缓解各种症状，并通过改变基因和蛋白的表达来调节生物途径。Lao等[14]通过概括蛋白质组学的应用，研究中医药补充治疗神经疾病、癌症、心血管疾病、糖尿病、免疫相关疾病的作用机制，取得了实质性的进展。Wang等[15]利用代谢组学和蛋白质组学方法来鉴定和评估抗丙型肝炎病毒感染的熊胆粉蛋白质(PBBP)，结果鉴定出38种生物标志物，发现两个独特的代谢途径在不同程度上影响丙型肝炎病毒动物。Chak KF等[16]在中国传统中药烫伤膏(Shiunko)对成纤维细胞及其应用于伤口愈合过程的研究中发现，被Shiunko诱导的成纤维细胞有差异蛋白表达，与抗氧化活性、细胞增殖、抗凋亡、胶原分泌和细胞运动等生理功能相关。Stathmin蛋白可能是伤口愈合过程的良好标志。Wang等[17]对中药栀子的主要成分栀子苷采用生化、代谢组学和蛋白质组学的治疗效果进行系统分析，发现栀子苷具有潜在的调节多种干扰途径的药理作用。Manavalan A等[18]通过研究天麻对大脑蛋白质代谢的定量蛋白质组学，获得了天麻治疗与脑功能之间有直接关系的证据。天麻的长期治疗可以通过下调如Gnao1、Dctn2等蛋白调节脑蛋白代谢。

中草药的药效作用靶点与机制不明确是中医药国际发展的一大障碍。通过蛋白质组学分析可以比较中草药作用前后相应靶器官或组织中蛋白质的变化，从而进行中药有效部位或有效成分作用靶点的识别，有利于中药作用机制的科学解释。

3 蛋白质组学技术对中医基本理论之证候学说的本质研究

证候是生命活动的表现特征，而生命活动的主要执行者则是蛋白质，基因决定蛋白质的表达，蛋白质的表达决定人的外表、特征、行为等，那么不同的“证”可能受不同的基因调控。而基因作为遗传信息的载体，均要表达为相应的蛋白质或修饰相关蛋白才能影响生物的功能。

周俊亮等[19]运用蛋白质组学技术，对中医气虚体质的组织和细胞进行蛋白质组分析，探索气虚体质与蛋白质组学之间的关系，建立“气虚体质-蛋白质指纹图谱”，进而尝试揭示中医气虚体质的科学内涵。Zhao等[20]对中医胸痹血瘀证行蛋白质组学研究发现，在患者血浆中α1-酸性糖蛋白等表达升高，载脂蛋白AIV等表达降低，并预测该差异蛋白可能作为冠心病血瘀证诊断或治疗的新靶标。张晓丽等[21]运用蛋白质组学技术进行正常、病理薄苔、厚苔和剥苔各20例的舌苔蛋白质组检测，筛选出具有明显表达差异的36个蛋白质点。赵慧辉等[22]采用差异凝胶双向电泳和质谱联用技术对冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者和健康人血浆进行比较研究，发现急性时相反应相蛋白(APR)、载脂蛋白和凝血相关蛋白三类差异蛋白，其中Fibrinogenβchain、Fibrinogenγchain、α1-Antitrypsin、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者中高表达，ApoA-IV、ApoA-I、Transthyretin、ApoJ在患者中低表达。Liu等[23]通过筛选和鉴定潜在生物标志物，成功地将结核病的3个中医证候进行区分，载脂蛋白C-III被确定为结核病中医证候的潜在生物标志物。黄金燕[24]通过蛋白组学技术分离并鉴定子宫内膜异位症(EM)血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者在位内膜的差异蛋白质，结果发现，EM血瘀证患者与健康妇女在位内膜之间有差异蛋白表达，Ang-2、Foxp3、MIF可能是潜在的EM血瘀证及其主要相关复合证肾虚血瘀证、气滞血瘀证的辨证相关分子标物；Survivin在各组的表达特异性较差，不适于作为指导诊断和辨证的备选分子。Liu等[25]通过筛选和鉴定在冠心病血瘀证中差异表达的活化血小板蛋白，解释活血药抗血小板的作用机制，并提供可用于血瘀证的许多潜在可用于评估抗血小板临床疗效的生物标志物。Song等[26]研究蛋白质组学、代谢组学等和证型分化的关系，总结了典型组学在普通疾病和中医辨证中的应用，并讨论了证型分化研究的主要问题及对策。Liu等[27]运用蛋白质组分析的方法——二维凝胶电泳(2-DE)与基质辅助激光解吸/电离飞行时间的质谱(MALDI-TOF-MS)，探索血浆蛋白质组和中医中慢性乙型肝炎(CHB)不同证型的联系。结果发现，在CHB 5个中医证候中，免疫球蛋白J-链(IGJ)和C反应蛋白(CRP)是上调的，而结合珠蛋白(HPT)、视黄醇结合蛋白(RBP)等被下调。IGJ可以作为不同证型慢性乙肝患者诊断的一种新的生物标志物。

中医证候学说是中医的特色理论之一，但其缺乏科学的量化标准，对于证候的判断往往是医生凭借经验，不同的医生其诊断的结果往往不同。而蛋白质组学技术应用于中医证候学说研究，是以蛋白质为切入点，深入进行证候实质的研究，在生物标志物的发现、证候的物质基础与量化表征方面具有独特优势。

4 蛋白质组学在方剂作用机理研究中的应用

方剂是在辨证论治的基础上按照组方原则，通过选择合适药物，酌定剂量，规定适宜剂型及用法等一系列过程形成的治疗处方。方剂具有多活性组分、多靶点、代谢途径复杂等特点，而分析寻找各作用靶点成为方剂作用机制和疗效研究的重点。苗兰等[28]研究血府逐瘀汤对气滞血瘀证模型大鼠血清蛋白质组表达的影响，利用双向凝胶电泳分离血清总蛋白，通过Image Master 2D Elite 6.01凝胶图像分析软件分析2-DE图谱，比较各组间蛋白表达谱的改变情况。经软件分析确定的差异蛋白点有7个，其中模型组大鼠血清与正常组相比有1个蛋白质下调，5个蛋白质上调，1个蛋白表达缺失，而给予血府逐瘀汤后可改善这些改变及缺失蛋白质的表达水平。

杨军等[29]用蛋白质组学的方法研究壮骨止痛方治疗骨质疏松的作用机理，建立去卵巢大鼠骨质疏松症模型，结合蛋白质生物信息库证实胰岛素受体蛋白、热休克同源M、道尔顿蛋白、分泌颗粒素NN在壮骨止痛方治疗骨质疏松病过程中发挥着重要的调控作用。高燕[30]通过三水白虎汤含药血清干预类风湿关节炎(RA)、骨关节炎(OA)患者的关节滑膜成纤维细胞，观察该方对细胞增殖的抑制情况。结果发现，三水白虎汤含药血清干预关节炎滑膜成纤维细胞后，11个蛋白在RA滑膜成纤维细胞中表达明显变化，15个蛋白在OA滑膜成纤维细胞中表达有明显差异。推测这些分子中部分可能与三水白虎汤抑制滑膜成纤维细胞增殖有关，其可能是该方治疗类风湿关节炎的作用机制之—。张颖[31]以卵巢切除大鼠作为绝经后骨质疏松症动物模型，用左归丸进行干预，应用蛋白组学方法从大鼠股骨骨髓中分析鉴定出11个差异蛋白质。这些差异蛋白质主要涉及能量代谢、抗氧化、信号传导、细胞增殖、分化和调亡等多方面的功能。说明在分子水平上左归丸可通过调节骨髓内细胞增殖、分化、凋亡和能量代谢以及氧化反应等来实现对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的预防作用。Wang等[32]分析茵陈蒿汤，证明其为有效的临床治疗肝损伤综合征的经典组合。茵陈蒿汤由黄花蒿、栀子和大黄构成，其主要活性成分分别为6，7-二甲基七叶亭(D)、京尼平苷(G)、和大黄酸(R)。将DGR组合施加在肝损伤的大鼠模型中，结果发现，DGR协同导致代谢生物标志物的动态变化，通过靶蛋白的分子调控网络，具有协同/相加效应。Sun等[33]利用双向电泳技术和MALDI技术进行中药复方茵陈蒿汤保肝作用的蛋白质组学研究，结果发现，用药后锌指蛋白407、触珠蛋白、巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶显著下调，运甲状腺素蛋白、维生素D结合蛋白、凝血酶原等显著上调，这些蛋白与代谢、能量产生、抗氧化、信号转导、蛋白质折叠和凋亡有关。Zheng等[34]在研究《金匮要略》方金公式时，运用蛋白质组学分析表明，热休克蛋白(HSP)如，HSP90AA1和HSPA1B，在金公式组明显下调。

方剂作用过程复杂，作用机制尚不明确。通过蛋白质组学研究方剂可直接比较药物组合对蛋白质数量、种类的影响与改变，探知作用靶点、作用过程，揭示药物与机体间的相互作用机制，同时又可发现复方中的有效成分及各成分间的协同关系，为复方的二次优化奠定基础。

5 总结与展望

蛋白质组具有整体性、动态性、时空性、复杂性等特征，这与中医基本理论体系十分吻合。以蛋白质组学为切入点进行中医药科学研究在现代实验研究中具有明显的优势[35]，主要表现在以下几方面：1)通过分析药用生物细胞内蛋白质组成、表达和修饰状态，可从分子水平解释药用生物自身遗传或对环境响应的分子机理，有利于从蛋白质层面对药用生物可利用物质的生物合成进行定向调控；2)对中医证候的蛋白质组学分析，建立某种证型特定的蛋白质数据库，有利于补充中医诊断的标准，为其提供客观准确的依据；3)蛋白质组学从整体出发进行中药作用靶点、方剂作用机制研究，有助于揭示中药方剂治疗疾病的分子作用机理，建立客观评价体系，为中药新药研发提供新的思路和方法[36]。

目前，蛋白质组学在中药材栽培、中药作用靶点、中医证候研究、方剂作用机制等方面已取得一定成果，但作为一门新兴学科，现仍处于不断发展和逐步完善的阶段，如相关的蛋白质组学研究技术仍不能完全满足研究的需要，或有些操作过程过于繁琐，需要技术发展以简化过程、提高效率等。尽管蛋白质组学在发展过程中还存在一些问题，但其应用的价值极大。现阶段，蛋白质组学正逐步与基因组学、转录组学、代谢组学整合，有望从中获得对中医药作用的全面综合认识，促进中医药事业快速发展。

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AdvancesofProteomicsinTraditionalChineseMedicineResearches

ZHU Yuwei1，2，YUQingyun1，2，LIUPei1*，ZHANGWeihua2，YUJingao1，LIHuiwei1，ZHANGYing1，ZHUYue1

(1.JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTCMFormulae，andJiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.BasicMedicalCollege，UniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

The research object of proteomics is all or part of the protein in living organism.Their role and function in biological processes were studied.In recent years，the application of proteomics is becoming more and more widely.In this paper，the application status in traditional Chinese medicine was reviewed，including the research of Chinese traditional medicine planting，the effect targets，the essence of TCM syndrome，the mechanism of formulae and so on.It would provide support for further application of proteomics in the effective mechanism revelation of traditional Chinese medicine.

Proteomics；traditional Chinese medicine research；application progress

2014-12-16)

国家自然科学基金项目(81202880)；江苏省大学生创新创业训练计划项目(201410315001Z)

*

刘培，助理研究员 ，研究方向：中药与方剂功效物质基础研究；Tel：(025)85811917，E-mail：liupeinj@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.028