新生鼠坏死性小肠结肠炎动物模型建立方法改进

刘斌　阎静江　李晓霞

[摘要] 目的 使用环境模拟实验装置建立一个更为标准及简便易行的新生儿坏死性小肠结肠炎动物模型造模方法。方法 75只新生24 h昆明小鼠随机分为5组，A1、A2和A3组采用人工喂养+缺氧复氧冷刺激+LPS灌胃；B组单纯人工喂养，C组为正常对照组。饲喂72 h后处死小鼠，进行肠道组织病理学评分。 结果 处理组新生鼠肠道组织与单纯人工喂养组及正常对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05），且实验结果重复性较好。 结论 使用环境模拟实验装置建立的NEC动物模型在病因学上符合NEC 的病理生理特点，并将动物模型造模装置规范化，改善了自制装置重复性较差的缺点，更适用于研究新生儿坏死性小肠结肠炎。

[关键词] 新生儿坏死性小肠结肠炎；肠道损伤；动物模型；新方法

[中图分类号] R725.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）35-0022-04

[Abstract] Objective To establish a standard and simple method of the neonatal necrotizing enterocolitis（NEC） animal model by the environment simulation equipment. Methods Seventy-five newborn mice at age of 24 hours were randomLy divided into 5 groups. Group A1 group， A2 group and A3 group were given artificial feeding， discontinuities cold/hypoxia exposure and LPS gavage. Group B was only given artificial feeding. Group C was a control group. Mice were sacrificed after being fed for 84 hours. Intestinal histopathology was scored. Results There was statistically significant between group A1， group B and group C （P<0.05）. In addition， all the repeated tests were obtained a same result. Conclusion The NEC animal model established by environmental simulation experiment was coincidence of the character of pathophysiology for NEC and improved the poor repeatability disadvantage， which made the NEC model device more normalizes. Thus， the model was very suitable to research NEC.

[Key words] Neonatal necrotizing enterocolitis； Injury of intestine； Animal model； New method

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一种具有潜在致死性的新生儿胃肠道急症，由于缺乏有效预防治疗措施，患儿死亡率较高，对新生儿存活率有着严重影响，从而受到临床医生和研究人员的高度重视。近年来，由于小儿重症监护病房（PICU）的应用及医务人员综合素质的提高，许多早产儿和低体重儿得以存活，NEC的发病率也随之有增加趋势[1-4]。因此，在NEC的研究中迫切需要建立一种简便易行、既高效又规范的新生儿NEC 动物模型建模方法，以进一步探求该疾病的发病机制并进行有效的预防治疗。由于目前国内外模型建立方法主要为自制实验器材，器材尚无统一标准[5-9]，故本研究目的是以国内外研究为基础，对建模器材及方法加以改进，建立一个标准且简单易行的新生儿NEC 动物模型造模方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

本次实验动物均购自山西医科大学，符合国标GB14922-94无特定病原体动物级质量标准。取用新生昆明小鼠75只，雌雄不限，体重约5～10 g。新生鼠出生24 h后即与母鼠分离，随机分成5组，处理组A1、A2和A3参考多因素联合造模方案[10]，持续处理72 h，并分别由不同实验员对处理组A1、A2和A3组分别进行操作；处理组B采用单纯人工喂养，持续处理72 h；对照组C采用母鼠乳喂养作为正常对照。

其中，处理组A1、A2、A3和处理组B出生后即置入环境模拟实验装置中通过鼠乳代用品进行人工喂养；对照组C测量体重并标记后返回各自母鼠旁，继续与母鼠同笼，鼠乳喂养。

实验过程中新生鼠如发生死亡或严重实验意外（如外伤、逃逸等）则进行排除，不计入实验结果。

1.2 主要试剂及仪器

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），雀巢特别能恩早产/低出生体重配方奶粉，英脱利匹特脂肪乳注射液（C14-24），小儿复方氨基酸注射液（19AA-Ⅰ），BD 密闭式静脉留置针24G，环境模拟实验装置（专利号201110214221.5）。

1.3 造模方法

1.3.1 人工喂养 新生鼠置于环境模拟实验装置内进行人工喂养，配制人工代乳品（表1）[11]，采用留置针去芯软针头进行管饲。喂养前用脱脂棉球蘸生理盐水对新生鼠口腔及面部皮肤进行清洁。人工喂养所使用的留置针每次使用完毕后即刻在流动水中清洗。清洁后使用75%医用酒精消毒，并密封保存。再次使用前应用灭菌生理盐水进行冲洗以去除表面附着的酒精。试验中使用的留置针每鼠一支，不重复使用。首日每次喂养量控制在不少于0.1 mL，以后每过24 h喂养量增加0.1 mL，每日喂养次数不少于8次，视新生鼠具体情况调整饲喂间隔，夜间新生鼠活动性下降，饲喂间隔可酌情延长。

1.3.2 缺氧复氧冷刺激 于实验状态的环境模拟实验装置内充入纯氮，箱内氧气浓度降至零后迅速将新生鼠由保育状态的环境模拟实验装置中转移至实验状态的环境模拟实验装置内，持续以1.5 L/min通入氮气，维持窒息 1 min后将提前4℃预冷处理的水袋放入环境模拟实验装置内，并将装置温度调至4℃，将新生鼠放置在水袋上进行低温处理，同时，持续以1.5 L/min流量通入氧气，控制氧浓度大于50%，刺激10 min。处理后将新生鼠移回保育状态的环境模拟实验装置，每日刺激3次。

1.3.3 LPS灌胃 LPS以10 g/kg稀释于0.1 mL灭菌水中，使用去芯留置针头通过口腔插管灌胃，每日1次，连续3 d。

1.4 标本采集

各组乳鼠每日定时称量体重，于造模开始后第72小时停止饲喂处死取标本。在小鼠腹部正中切开腹腔，分离肠血管及系膜。取回盲部及其远近端共5 cm肠管置入包埋盒进行石蜡包埋，所有标本采集均在冰上完成。

1.5 肠组织病理学检查与评分

回盲部及其远近端共5 cm肠管石蜡包埋后，作4～5 μm 连续切片，常规HE 染色，采用随机数法对每个切片进行随机编号，观片人员采用盲法对每个标本进行肠道组织的病理学评分，病理学评分采用双盲法，评分标准参考Nadler标准[12]。评分细则如下：0分：肠道组织结构正常，肠道上皮、绒毛完整；1分：黏膜下或固有层轻有微肿胀分离；2分：黏膜下和（或）固有层中度分离，黏膜下和（或）肌层水肿；3分：黏膜下和（或）固有层重度分离，黏膜下和（或）肌层水肿，局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失并伴有肠坏死等。评分≥2分者视为模型动物发生了NEC病理改变。

1.6 统计学分析

数据分析用SPSS11.5（SPSS公司，美国）软件在Windows XP环境下进行。计量数据资料使用中位数和四分位数间距M（Q）表示，多组间数据比较采用Kruskal-Wallis H 秩和检验法进行分析，进一步根据平均秩次进行两两比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

处理组A1、A2、A3组新生鼠在实验开始后24 h内即出现主动活动减少，对外界刺激反应减缓甚至消失。同时伴有排黄绿色甚至黑色稀便等大便性状的改变。开始实验后处理组A1、A2、A3组和处理组B组新生鼠均出现不同程度出现腹胀和胃潴留的症状。对照组C组生长发育无明显异常，体重增长稳定，主动活动及对外界刺激反应良好，进食及排便正常，无消化道异常表现。

2.2 外观改变

处理组A1、A2、A3组和处理组B组肠道组织均与对照组相比有明显差异。处理组A1、A2和A3组肠道外观改变较为明显，回盲部近端大段肠管外观呈黑红色，光泽度及弹性明显下降。处理组B 组可见回盲部近端肠管颜色呈黄红色，部分肠管可见污黄色，光泽和弹性较正常组织有下降。此外，处理组A1、A2、A3组和处理组B组新生鼠肠腔内均有不同程度积气，少数重度者可呈串珠样，尚无肠穿孔症状出现。对照组C组肠管颜色粉嫩，有光泽，弹性良好，未见积气。

2.3 病理学改变

在处理组A1、A2、A3组新生鼠肠道组织病理可见明显坏死。镜下可见肠壁绒毛变性水肿，坏死、甚至脱落消失。肠壁内腺体排列紊乱，甚至消失，肠道肌层不同程度变薄甚至部分断裂。重度固有层及黏膜下层水肿，伴有大量炎性细胞浸润，病理学评分均为 3～4 分（封三图1），与正常对照组新生鼠相比有统计学意义（P<0.05）。处理组B组新生鼠镜下可见中度绒毛充血水肿，腺体排列紊乱，个别可见轻度的坏死，部分伴有中性粒细胞浸润，与处理组A1、A2、A3组新生鼠炎症程度差异有统计学意义（P<0.05），且与正常对照组C组新生鼠差异有统计学意义（P<0.05）。正常对照组C组新生鼠的肠道结构完整，未见明显病理学改变。见表2。

3 讨论

小肠及结肠的广泛斑片状坏死是NEC的主要特征，一旦发生即可在短期内引发全身性败血症和多器官功能衰竭，进而导致死亡。迄今为止，NEC确切的病因及发病机制尚未被完全阐明，现阶段的研究仅提示：不当人工喂养、早产及感染等是NEC发病的危险因素。近年来国内外大量研究也显示：循环LPS浓度在NEC患者和NEC的动物模型中均呈升高趋势[13]；而且循环LPS浓度的增加可进一步破坏肠道上皮细胞[14]，并激活白细胞，释放大量炎性细胞因子[15]。综合以上观点认为NEC的主要病理生理过程为：多种因素相互作用下导致的黏膜损伤诱发患儿产生继发性免疫应答，进一步导致肠道黏膜内抗炎—促炎因子平衡的失衡，从而引起一系列肠道坏死性改变。

目前大部分NEC动物模型造模采用的都是自制实验装备，因为装备制作工艺和功能的限制，导致了NEC动物模型在造模过程中无法规范实验条件，其他实验室在进行重复实验时无法还原参考文献中的造模条件，导致NEC动物模型造模实验条件实际上各不相同。特别是实验中无规范的新生动物保育措施，容易导致模型动物本身处于非保育状态，对实验结果产生干扰，甚至出现意外死亡。本研究采用了环境模拟实验装置（专利号201110214221.5）替代大多数文献中使用的自制新生鼠保育装置，该装置优势在于可以通过显示器实时监控保育箱温度、湿度、氧浓度及气压等多项指标，并可通过程序自动调节气体排量，维持稳定气压，可以避免实验气体大量快速进入而造成的实验动物损伤，通过负压排气装置配合内部空气循环装置可以在短时间将气体完全置换，且气密性较好，不易发生漏气或换气不全等情况，特别适合于新生动物保育及缺氧窒息等特殊通气条件下的动物实验。本研究中还将多因素联合造模实验分为3次进行，由不同实验人员在不同时间段进行，正式实验前需通过几次预实验使实验人员对人工喂养技术和环境模拟实验装置操作进行熟悉，减少因为操作生疏造成的实验动物意外伤害，最终重复实验结果之间并无明显统计学差异（表2），证明使用环境实验模拟装置制作的NEC动物模型可重复性较强，有利于实验模型的推广和改进。

在本研究前期预实验中发现，国内外文献普遍提及的缺氧窒息时间为10 min甚至更长[10]，但实际使用环境模拟实验装置进行缺氧窒息2 min后动物死亡率就达100%，多次重复实验均呈类似结果，因无法还原其他实验室自制保育装置难以具体分析其实际原因，因此根据预实验结果将本研究中缺氧窒息时间调整为1 min，在保证尽可能减少实验动物意外死亡的前提下给予适当的缺氧窒息。

在临床实践中，NEC 最常见的发病原因是早产儿喂养不当和缺氧，感染等导致的，其中喂养不当往往是最主要的致病原因，部分患儿出生后仅有喂养不当史而无缺氧窒息和感染史，因此本实验将人工喂养作为单一条件进行造模，并与多因素联合造模进行比较，病理结果显示，人工喂养作为单一因素造模也会造成肠道损伤，但与多因素联合造模结果相比肠道损伤程度差异有统计学意义（P<0.05），多因素联合造模更接近NEC发病的临床特征，更为科学合理。本研究中单纯人工喂养的新生鼠病理评分为1（1）分[M（Q）]，肠道损伤程度较轻，且未发生意外死亡及其他疾病表现，新生鼠活动性及外观状况接近于鼠乳喂养新生鼠，说明环境模拟实验装置保育性能较好，在非实验状态可以给予动物较为稳定的保育环境。

本研究中使用环境模拟实验装置建立的NEC动物模型采用多因素联合造模方式，综合了临床常见的危险因素包括：早产、产后窒息、肠道致病菌感染、不当人工喂养、缺血再灌注损伤等，符合NEC 的病理生理特点。本研究中使用的环境模拟实验装置将NEC动物模型造模装置规范化，改善了自制装置重复性较差的缺点，加强了非实验状态下的保育措施，更适用于新生儿坏死性小肠结肠炎的研究。

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（收稿日期：2015-09-21）