超高效液相色谱测定猪肉中喹乙醇的残留量

刘　淳

(北京市东城区疾病预防控制中心 ，北京 100009)



超高效液相色谱测定猪肉中喹乙醇的残留量

刘淳

(北京市东城区疾病预防控制中心 ，北京 100009)

摘要：建立了超高效液相色谱测定猪肉中喹乙醇的方法。样品温水提取，用亚铁氯化钾和乙酸锌沉淀蛋白，超高效液相色谱-紫外检测器测定。色谱柱BEH C181.7μm× 50mm×2.1mm，用不同体积的甲醇和水混合作为流动相梯度洗脱，检测波长380nm；流速0.3mL/min；柱温40℃；进样量3μL。喹乙醇的质量浓度分别一定范围内与其峰面积呈线性关系，检出限(3S/N)为0.015μg/g。以空白猪肉为基体进行加标回收试验，回收率在92.3%～97.8%之间，相对标准偏差(n=6)在1.2%～2.6%之间。结论：本方法适用于猪肉中喹乙醇的测定。

关键词：超高效液相色谱法；喹乙醇；残留量；猪肉

喹乙醇(Olaquindox)是1965年由德国Bayer公司以邻硝基苯胺为原料合成的一种抗菌促生长剂，最初用于防治仔猪腹泻，1976年欧共体批准用于畜禽饲料添加剂，国内于1981年研制成功，广泛应用于养殖业。喹乙醇的毒性随动物种属不同存在较大差异，特别对禽和鱼类，有中度至明显蓄积毒性和一定遗传毒性，对部分鱼类有明显致畸作用。鉴于此，中华人民共和国兽药典明确规定，喹乙醇作为抗菌促生长剂，仅限用于35kg以下猪的促生长，以及防治仔猪黄痢、白痢，猪沙门氏菌感染，休药期35d；禁用于体重超过35kg以上的猪和禽、鱼等其他种类动物[1-14]。

1仪器及试剂

1.1　仪器

H-Class超高效液相色谱仪：美国Waters公司；3-30K冷冻高速离心机：Sigma公司；S XS204电子天平：梅特勒-托利多公司；纯水机：法国Milli-Q公司；K-1快速混匀器：国华仪器厂；新佳水浴恒温振荡锅：江苏省金杨市洪华仪器厂； H127633飞利浦食品加工机：飞利浦公司。

1.2　试剂

甲醇：色谱纯；亚铁氯化钾：分析纯；乙酸锌：分析纯；喹乙醇标准品：Dr.Ehrenstrfer公司

1.2.1　喹乙醇标准储备液

精确称取喹乙醇标准品0.0100g，用少量高纯水溶解，并转移到100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此喹乙醇标准储备液浓度100.00μg/mL。

1.2.2　喹乙醇标准使用液

取喹乙醇标准储备液10.00mL，转移到100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此喹乙醇标准使用液浓度10.00μg/mL。此标准使用液需置于棕色容量瓶内避光冷藏保存，保存期1个月，使用时再用甲醇稀释至所需浓度。

2试验方法

2.1　样品提取

取适量粉碎混匀的样品于50mL离心管中，加10.0mL高纯水，漩涡混匀30s，放入恒温水浴中60℃避光振荡提取15min[1]。取出加入5.0mL亚铁氯化钾和5.0mL乙酸锌沉淀蛋白，用高纯水定容至25.00mL，10000r/min离心10min，避光静置20min。取上清液过0.22μm微孔滤膜，待测。

2.2　色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相甲醇(A)+水(B)，梯度洗脱条件见表1[2]；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：3μL。

2.3　标准工作曲线的制作

取适量喹乙醇标准使用液，用流动相稀释成喹乙醇浓度分别为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL系列标准工作液。根据喹乙醇标准品的保留时间定性，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

表1　流动相梯度洗脱程序

2.4　回收率和精密度

称取10g空白样品，加入不同量的喹乙醇标准溶液，漩涡混匀放置30min后按上述方法进行前处理和上机分析。

3结果分析与讨论

3.1　样品色谱图

按色谱条件进行分析，图1为喹乙醇标准品的色谱图，其保留时间为1.190min，峰型良好。图2为未添加喹乙醇的猪肉样品的色谱图，杂质峰和溶剂峰分别在1.00min之前和2.00min之后。图3为添加0.04μg/mL喹乙醇猪肉样品色谱图，喹乙醇保留时间为1.204min，喹乙醇能良好地和猪肉中的杂质分开，说明上述检测猪肉中喹乙醇残留量的色谱条件和样品前处理方法是可行的。

图1　喹乙醇(OLA)标准品色谱图

图2　未添加喹乙醇(OLA)猪肉样品色谱图

图3　添加0.04μg/mL喹乙醇(OLA)猪肉样品色谱图

3.2　标准曲线结果及检出限

分别配制喹乙醇标准品工作曲线浓度为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL；1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL。

实验结果表明喹乙醇浓度在0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL；1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程分别为y=22991x+87.00和y=23240x+39.16，相关系数为R2=0.9999，工作曲线如图4和图5所示。以10倍信噪比为基准，经实际加标测得喹乙醇在猪肉中检出限为0.05μg/g。

图4　喹乙醇工作曲线图线性范围：0.10～2.00μg/mL

图5　喹乙醇工作曲线图线性范围：1.00～20.00μg/mL

3.3　准确度和精密度

对0.10μg/mL，1.00μg/mL标准溶液分别进行6次重复测定，结果见表2，标准偏差为1.7%和0.3%。

表2　精密度试验(n=6)

以空白猪肉为测试对象，通过由低到高的3个浓度下加标回收率和精密度实验，以考察方法的准确度和精密度。另选定加标浓度的空白猪肉样品，连续测定3d，计算批件间精密度，实验结果见表3和表4。

表3　空白样品不同加标浓度下的回收率和精密度实验(n=6)

表4　批间精密度实验(n=6)

从实验结果可知在加标量为0.10、1.00、2.00三个梯度下，回收率在92%～103%之间，相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差也小于10%，结果表明该方法回收率和精密度可以满足兽药残留检测要求。

4讨论

喹乙醇极易溶于热水，所以采用温水提取喹乙醇。为消除杂质对喹乙醇的干扰及降低检出限，采用沉淀蛋白的方法，纯化提取喹乙醇，经过试验研究，该法获得成功。

喹乙醇见光分解速度很快，要获得理想的回收率和较低的检出限，必须对样品前处理进行全程避光操作，标准使用液要贮存在棕色容量瓶中。

方法具有操作简单、准确度高、重现性好，检出限低等优点，可进行猪肉批量检测。

参考文献

[1]于慧娟,毕士川,黄冬梅. 高效液相色谱测定水产品中喹乙醇的残留量. 分析科学学报，2004,20(3):281-283.

[2]梅光明,郑斌,陈学昌. 超高效液相色谱-质谱联用法测定水产品中喹乙醇代谢物的残留量.浙江海洋学院学报(自然科学版),2010,29(3):254-259.

[3]田蕴,蒋向君,贺燕,葛敏. 高效液相色谱法测定猪肉中喹乙醇. 中国畜牧兽医文摘,2011,27(5):1844.

[4]范伟军. 复方制剂中痢菌净和喹乙醇的含量测定方法研究. 广西畜牧兽医,2001,17(1):6-7.

[5]叶广茂,邹伟东,梁华明. 采用等吸收点方法测定兽药克痢顿中的喹乙醇含量. 辽宁畜牧兽医，2003(3):31-32.

[6]刘同民,权仁子. 一阶导数分光光度法测定促生长剂中喹乙醇的含量. 中国兽药杂志，2000,34(3):30-31.

[7]王文杰. 应用近红外光谱分析技术快速监测预混添加剂中的喹乙. 饲料研究,1992(10):9-10.

[8]刘安南. 薄层色谱法鉴别中西复方制剂中喹乙醇成分. 江西饲料, 2001(1):23.

[9]叶红丽,李涛. 高效液相色谱法用于鸡蛋中喹乙醇的检测. 中国兽药杂志.1990, (2):15-17.

[10]艾晓辉,刘长征,文华. 鱼组织中喹乙醇残留量高效液相色谱检测方研究. 湖北农学院学报, 2003,23(4):266-270.

[11]宫秀杰. 高效液相色谱法测定饲料中喹乙醇含量. 中国兽药杂志,2008,42(10): 32-34.

[12]曾静,朱宽正,王鹏. 高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中的喹乙醇. 中国食品卫生杂志,2006,18(5): 423-425.

[13]张海琪,何中央,徐晓林. 液相色谱-串联质谱法测定水产饲料中喹乙醇残留量. 水生态学杂志2009,2(1):131-134.

[14]朱学加. 喹乙醇单克隆抗体制备与初步应用研究.北京:中国农业大学,2007.

Determination of olaqunindox residue in pork by ultra high performance liquid chromatography.

LiuChun(CenterforDiseaseControlandPreventionofDongchengDistrictofBeijing,Beijing100009,China)

Abstract:The target analyst was extract form samples with water, involved protein precipitation with zinc acetate and ferrous potassium chloride. Chromatographic column: BEH C181.7μm×50 mm×2.1mm, detection wavelength: 380nm, flow rate: 0.3mL/min, column temperature: 40℃, injection volume: 3μL, and separated with mixtures of methanol and water mixed in different rations as mobile phases. Result: Linear relationships between values of peak area and concentration of olaqunindox was obtained in the definite rages, with detection limits of(3S/N)0.05μg/g. Using samples of blank pork as matrixes, tests for recovery were made by standard addition method, and values of recovery were in rage of 92%-103%, and values of RSD’s (n=6)were in the rage of 1.2%-2.6%. The method is suitable for determination of olaqunindox residue in pork.

Key words：UPLC; olaqunindox; residue; pork

收稿日期：2014-08-08

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.02.010

作者简介：刘淳，女，1986出生，检验士，硕士研究生，主要从事食品理化检验工作。