苜蓿对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗性评价研究

2016-01-27王瑜刘怡周彬彬袁庆华张丽潘龙其

草业学报 2015年7期

关键词：紫花苜蓿抗病性

王瑜，刘怡，周彬彬，袁庆华*，张丽,2，潘龙其,2

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州 730070)

苜蓿对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗性评价研究

王瑜1，刘怡1，周彬彬1，袁庆华1*，张丽1,2，潘龙其1,2

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州 730070)

摘要：为探明不同紫花苜蓿品种对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗性，本研究采用温室内孢子悬浮液喷雾接种法，对来自国内外的40个苜蓿品种进行了苗期抗病性鉴定和评价，同时，对接种浓度进行研究。研究结果表明，随着孢子悬浮液浓度的升高，10个品种匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的病情指数均呈现逐渐升高的趋势，匍柄霉叶斑病的适宜接种浓度为1×105～1×106个孢子/mL，茎点霉叶斑病的适宜接种浓度为1×106个孢子/mL。在1×106个孢子/mL 的接种浓度下，40个苜蓿品种匍柄霉叶斑病的病情指数为3.33～35.83，茎点霉叶斑病的病情指数为13.07～52.27，品种间均存在显著差异(P<0.05)。从中筛选出抗匍柄霉叶斑病品种14份，其中，高抗品种1份(公农2号)，中抗品种13份；从中筛选出抗茎点霉叶斑病品种1份，为来自美国的中抗品种润布勒。

关键词：紫花苜蓿；匍柄霉叶斑病；茎点霉叶斑病；抗病性

DOI：10.11686/cyxb2014337

Wang Y, Liu Y, Zhou B B, Yuan Q H, Zhang L, Pan L Q. An evaluation of the resistance of alfalfa cultivars toStemphyliumandPhomaleaf spot diseases. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(7): 155-162.

王瑜，刘怡，周彬彬，袁庆华，张丽，潘龙其. 苜蓿对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗性评价研究. 草业学报, 2015, 24(7): 155-162.

http://cyxb.lzu.edu.cn

收稿日期：2014-08-20；改回日期：2014-12-25

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划课题(2011BAD17B01)和公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303057)资助。

作者简介：王瑜(1981-)，女，山东威海人，助理研究员。 E-mail:yuwang-99@hotmail.com

通讯作者*Corresponding author. E-mail:yuanqinghua@hotmail.com

Abstract:Forty alfalfa (Medicago sativa) cultivars were collected from China and abroad and inoculated with suspensions of different concentrations of spores from Stemphylium leaf spot and Phoma leaf spot diseases to evaluate the resistance of alfalfa to these two leaf spot diseases and identify the optimal inoculation concentration. The disease indices of 10 cultivars inoculated with these two fungi gradually increased with concentration increase of the spore suspensions. The appropriate inoculation concentrations for comparing cultivar resistance to Stemphylium and Phoma were 1×105to 1×106spores per milliliter and 1×106spores per milliliter, respectively. With a concentration of 1×106spores per milliliter in the inoculate, the disease indices of Stemphylium leaf spot in forty cultivars ranged from 3.33 to 35.83, while the disease indices of Phoma leaf spot ranged from 13.07 to 52.27. There were significant differences between the 40 cultivars (P<0.05). Fourteen cultivars were found to be resistant to Stemphylium leaf spot, including one highly-resistant cultivar-Gongnong No.2 and thirteen moderately-resistant cultivars. Only one cultivar, Rambler, from America was found to have moderate resistance to Phoma leaf spot.

An evaluation of the resistance of alfalfa cultivars toStemphyliumandPhomaleaf spot diseases

WANG Yu1, LIU Yi1, ZHOU Bin-Bin1, YUAN Qing-Hua1*, ZHANG Li1,2, PAN Long-Qi1,2

1.InstituteofAnimalScienceofCAAS,Beijing100193,China; 2.CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Key words: alfalfa (Medicagosativa);Stemphyliumleaf spot;Phomaleaf spot; disease resistance

紫花苜蓿(Medicagosativa)是全世界最重要的豆科牧草，因其具有品质优良、适口性好、饲用形式多样、饲用价值高和良好的生态效应，被冠以“牧草之王”的美称[1-3]。近年来，随着我国苜蓿种植面积的进一步扩大，苜蓿病害问题也日趋严重，已成为制约苜蓿产业发展的重要因素之一[4]。其中，苜蓿叶部病害是引起草场退化、草产量减少、草产品质量下降的重要原因[5]。苜蓿匍柄霉叶斑病(Stemphyliumleaf spot)又称苜蓿轮斑病，是由匍柄霉(Stemphyliumbotryosum)引起的叶部病害。该病广泛发生于美国、澳大利亚、新西兰等国家，在我国的华北、东北与西北等苜蓿主产区也有该病发生的记录，已同锈病、霜霉病、褐斑病并列为中国普遍发生、危害较重的叶部病害[6-9]。匍柄霉叶斑病发生严重时会导致叶片大量脱落，荚果生长期缩短，种子产量降低50%，叶片中香豆醇含量显著增高[10]。

苜蓿茎点霉叶斑病又称春季黑茎与叶斑病(spring black stem and leaf spot)，是由苜蓿茎点霉(Phomamedicaginisvar.medicaginis)引起的叶部病害。该病是一种广泛发生的世界性病害，在我国的吉林、甘肃、内蒙古、河北、陕西等地均有发现[11-12]。苜蓿茎点霉叶斑病发生严重时使苜蓿干草产量减产40%～50%，种子产量减产30%，在生长季中期和后期，此病常发生非常严重，对许多大叶型品种(如新疆的和阗苜蓿、沙湾苜蓿、布尔津苜蓿，以及从美国和苏联引进的许多品种)危害很大，株发病率可高达80%～100%[11]。

选用抗病品种是苜蓿病害防治最为经济有效的方法，对苜蓿霜霉病[13]与褐斑病[14]等叶部病害，国内已有研究者进行了抗病种质材料筛选研究。对匍柄霉叶斑病[6,15-16]与茎点霉叶斑病[17]国外已有研究者针对国外苜蓿品种进行了抗病性鉴定与评价，国内则仅有研究者进行了匍柄霉叶斑病[18-19]的抗病性评价，针对茎点霉叶斑病的抗性评价鉴定尚无报道。本研究通过温室内孢子悬浮液喷雾接种法，对来自国内外的40个苜蓿品种分别进行匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗病性鉴定与评价，以筛选抗病品种，为我国苜蓿种植中抗病品种的选择与抗病育种提供参考依据。

1材料与方法

1.1　供试材料

苜蓿品种：本试验所用40个苜蓿品种(表1)由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草种质资源研究室提供，其中，来自国外的品种24个，来自国内的品种16个。

供试菌株：匍柄霉与苜蓿茎点霉菌种分别采自内蒙古阿鲁科尔沁旗田园牧歌草业公司生产基地与吉林农业科学院试验基地，经室内分离纯化扩繁及致病性鉴定后，接种于 PDA培养基上，4℃保存备用。

1.2　研究方法

1.2.1育苗试验于2014年3-8月在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所廊坊基地进行。将苜蓿种子用0.1% 升汞消毒3～5 min，无菌水冲洗4次，之后放在消毒培养皿的滤纸上，加适量灭菌水以保持种子吸水膨胀。将培养皿放入20℃培养箱内，待种子发芽至幼根长到1 cm长时移植到装有灭菌草炭与壤土(1∶1)的塑料盘中，塑料盘规格为60 cm×45 cm×15 cm(长×宽×高)。移植时，每个塑料盘划分为10行，每行种植1个品种(10株/行)，每品种3个重复，25℃温室内培养6周后进行接种。

1.2.2接种方法采用孢子悬浮液喷雾接种法。分别配制浓度为1×107，1×106和1×105个孢子/mL的分生孢子悬浮液，在2 h内用喉头喷雾器将其均匀喷洒在苜蓿叶片上，每盘用量为40 mL，覆盖黑色塑料薄膜以确保100%相对空气湿度，23℃黑暗保湿24 h，之后移去塑料薄膜，25℃温室内正常管理。12 d后进行病情调查。

随机选择4(阿伯罗Ⅱ)、8(定襄)、12(呼图壁)、16(雷西斯)、20(南特)、24(切罗克)、28(泰安)、32(焉耆)、36(印第安)、40(费纳尔)等10个品种进行3个浓度孢子悬浮液喷雾接种，根据病情指数筛选适宜的接种浓度。之后，利用筛选出的适宜接种浓度对40份材料进行接种。

1.2.3病情调查对每株苜蓿每个叶片的病情级别进行调查，根据小叶病斑占叶面积的百分比对叶片进行病害分级。

匍柄霉叶斑病的分级标准为，0级：无病斑；1级：小叶病斑面积占叶面积的1%~5%；2级：小叶病斑面积占叶面积的5%~15%；3级：小叶病斑面积占叶面积的15%~25%；4级：小叶病斑面积占叶面积的25%以上。

茎点霉叶斑病的分级标准为，0级：无病斑；1级：小叶病斑占叶面积的1%~5%；2 级：小叶病斑占叶面积的5%~15%；3 级：小叶病斑占叶面积的15%~25%；4 级：小叶病斑占叶面积的25%~35%；5 级：小叶病斑占叶面积的35%以上。

计算各品种的发病率和病情指数，每品种3次重复，每重复统计10株。

发病率(%)=(病株数/总株数)×100

1.2.4抗病级别划分根据各品种苜蓿的病情指数分别对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗病级别进行划分，分级标准为：病情指数<5为高抗；5≤病情指数≤15为中抗；15<病情指数≤25为中感；病情指数>25为高感。

1.3　数据处理

利用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，用Duncan法进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1　孢子悬浮液浓度的筛选

3个孢子悬浮液浓度下，10个品种间匍柄霉叶斑病的病情指数均存在显著差异(P<0.05)，随着孢子悬浮液浓度的升高，各品种的病情指数均呈现升高的趋势(图1)。当孢子悬浮液浓度为1×105个孢子/mL时，10个品种匍柄霉叶斑病的病情指数为4.67～28.33；当孢子悬浮液浓度为1×106个孢子/mL 时，病情指数为7.50～35.83；当孢子悬浮液浓度为1×107个孢子/mL 时，病情指数为36.67～66.67，该浓度下10个品种的病情指数普遍较高，均表现为高度感病，不利于区分抗感材料。因此，1×105～1×106个孢子/mL 为匍柄霉叶斑病适宜的接种浓度，本试验后期采用1×106个孢子/mL。

图1　匍柄霉孢子悬浮液不同接种浓度对10个苜蓿品种病情指数的影响Fig.1　Effect of different inoculation concentration of S. botryosum spores suspension on disease index of ten alfalfa cultivars　同一孢子悬浮液浓度下的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different small letters under the same spores concentration show significant differences (P<0.05). The same below.

随着孢子悬浮液浓度的升高，各品种茎点霉叶斑病的病情指数也呈现升高的趋势(图2)。当孢子悬浮液浓度为1×105个孢子/mL时，10个品种茎点霉叶斑病的病情指数为14.93～21.33，各材料间无显著差异；当孢子悬浮液浓度为1×106个孢子/mL时，病情指数为20.00～39.20，材料间存在显著差异(P<0.05)；当孢子悬浮液浓度为1×107个孢子/mL时，病情指数为30.67～66.13，材料间也存在显著差异(P<0.05)，但该浓度下10个品种的病情指数也普遍较高，均表现为高度感病，不利于区分抗感材料。因此，茎点霉叶斑病的适宜接种浓度为1×106个孢子/mL。

表1　苜蓿品种及来源

注：FAO为联合国粮食及农业组织的简称。

图2　茎点霉孢子悬浮液不同接种浓度对10个苜蓿品种病情指数的影响Fig.2　Effect of different inoculation concentration of P. medicaginis var. medicaginis spores suspension on disease index of ten alfalfa cultivars

Note: FAO is the abbreviation of Food and Agriculture Organization.

2.2　对匍柄霉叶斑病的抗病性

40份材料间匍柄霉叶斑病的病情指数存在显著差异(P<0.05)，发病率亦存在显著差异(P<0.05)(表2)。病情指数的变化范围为3.33～35.83，发病率的变化范围为13.33%～96.67%，表明不同品种苜蓿材料对匍柄霉叶斑病的抗性存在较大差异。根据频率分布图(图3)可知，病情指数小于5的高抗材料有1份；病情指数为5～15的中抗材料有13份；病情指数为15～25的中感材料有14份；病情指数大于25的高感材料有12份。由此可见，40份材料中，只有2.5%(1份)的材料为高抗材料，有32.5%(13份)的材料为中抗材料，其余65.0%(26份)均为感病材料。高抗匍柄霉叶斑病材料为来自陕西的公农2号。

图3　40个苜蓿品种匍柄霉与茎点霉叶斑病病情指数的频率分布Fig.3　Distribution of disease index of Stemphylium and Phoma leaf spot in forty alfalfa cultivars

表2　40个苜蓿品种匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的病情分级

HR: 高抗High resistance; MR: 中抗Medium resistance; HS: 高感High susceptibility; MS: 中感Medium susceptibility.

2.3　对茎点霉叶斑病的抗病性

40份材料间茎点霉叶斑病的病情指数存在显著差异(P<0.05)(表2)，发病率均为100%,无差异。病情指数的变化范围为13.07～52.27，表明不同品种苜蓿材料对茎点霉叶斑病的抗性也存在较大差异。根据频率分布图(图3)可知，病情指数小于5的高抗材料有0份；病情指数为5～15的中抗材料有1份；病情指数为15～25的中感材料有14份；病情指数大于25的高感材料有25份。由此可见，40份材料中无高抗材料，只有2.5%(1份)的材料为中抗材料，其余97.5%(39份)均为感病材料。中抗茎点霉叶斑病材料为来自美国的润布勒。

3讨论与结论

3.1　接种浓度

北美苜蓿协会(NAAIC)于1991年曾提出苜蓿品种对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病抗病性的测定标准，包括苜蓿幼苗培养、菌株培养、接种方法与条件、病害分级等方面(http://www.naaic.org/stdtests)。其中，菌液浓度的高低是接种成败的关键，各种病害接种评价中使用的菌液浓度不尽相同。在NAAIC的标准中，匍柄霉叶斑病的建议浓度为1×104～5×104个孢子/mL，茎点霉叶斑病的建议浓度为1×106～4×106个孢子/mL。

在本研究的匍柄霉叶斑病接种鉴定中，当孢子悬浮液浓度为1×105～1×106个孢子/mL时，10个品种的病情指数为4.67～45.83，材料间存在显著差异，可以区分抗感材料，为适宜的接种浓度。当孢子悬浮液浓度为1×107个孢子/mL时，10份材料的病情指数普遍偏高，均表现为高度感病，不利于区分抗感材料，且浪费菌源。张静妮[18]在对苜蓿进行匍柄霉叶斑病接种鉴定的过程中发现,5×105～1×106个孢子/mL为适宜的接种浓度，本研究的结果与此基本一致。

在茎点霉叶斑病的接种鉴定中，当孢子悬浮液浓度为1×105个孢子/mL时，10个品种的病情指数间无显著差异；当孢子悬浮液浓度为1×106与1×107个孢子/mL时，10个品种间均存在显著差异(P<0.05)，但在1×107个孢子/mL浓度时，10个品种的病情指数普遍较高，均表现为高度感病，不利于区分抗感材料。因此，茎点霉叶斑病的适宜接种浓度为1×106个孢子/mL，与NAAIC建议的浓度一致，另外，Castell-Miller等[17]研究茎点霉在抗感紫花苜蓿种质材料植株内的侵染与扩展时所采用的接种浓度为1.2×106～1.6×106个孢子/mL，本研究的结果与此也基本一致。

3.2　抗病品种筛选

本研究从40份苜蓿种质材料中筛选出高抗匍柄霉叶斑病材料1份，为来自陕西的公农2号，中抗材料13份(5份国内材料，8份国外材料)，中感材料14份(4份国内材料，10份国外材料)，高感材料12份(6份国内材料，6份国外材料)。其中，来自国内的16份材料中，高抗材料占 6.25%，中抗材料占31.25%，中感材料占25.0%，高感材料占37.5%；来自国外的24份材料中，高抗材料占0%，中抗材料占33.33%，中感材料占41.67%，高感材料占25.00%。表现为抗病的14份材料分别为：公农2号，C/W5，阿罗特，定襄，阜康，兰格勒，罗佑玛，帕拉维沃，润布勒，渃瓦，维勒，兴平，焉耆，沂阳。Borges等[15]通过对不同苜蓿属匍柄霉叶斑病抗性的研究发现Medicagocancellata，野苜蓿(M.falcata)，M.coerulea和M.hemicycla等4个苜蓿属均高抗匍柄霉叶斑病，而紫花苜蓿则均表现为感病。Lucas等[16]曾于1973年通过田间与室内的接种鉴定，从4个紫花苜蓿品种中筛选出Apalachee具有较好的匍柄霉叶斑病抗性。国内的研究者中，张静妮[18]通过对50个紫花苜蓿品种的室内接种鉴定筛选出抗匍柄霉叶斑病品种3个，分别为公农1号，庆阳，BL-201(品系)。黄宁[19]则通过对44个品种的离体叶接种鉴定筛选出公农2号、BL-201(品系)等15个高抗品种。本研究中公农2号也表现为高抗，与黄宁[19]的研究结果一致，表明试验结果可靠，可将其作为匍柄霉叶斑病抗病种质资源加以发掘利用。

经茎点霉接种鉴定发现40份紫花苜蓿种质材料的发病率均为100%，所有植株均呈现不同程度的染病状态，病情指数为13.07～52.27。从40份材料中筛选出中抗材料1份，为来自美国的润布勒，中感材料14份(7份国内材料，7份国外材料)，高感材料25份(9份国内材料，16份国外材料)。其中，来自国内的16份材料均表现为感病，中感材料占43.75%，高感材料占56.25%；来自国外的24份材料中，中抗材料占4.16%，中感材料占29.17%，高感材料占66.67%。综合而言，只有来自美国的润布勒具茎点霉中等抗性，其余材料均表现为感病。NAAIC公布的茎点霉叶斑病抗病对照品种为“PL-PhR”和“Ramsey”，感病对照品种为“Ranger”和“Lahontan”。

品种的抗病性除取决于自身外,还受各种因素的影响，因此,在通过温室试验筛选得到抗病品种后，还需要在后期进行大田自然环境下的跟踪试验[20]。

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