大豆GmAGL8基因的克隆及生物信息学分析

李冉阳， 秦玉涛， 张 倩， 吴 婧， 谢 皓， 郭 蓓,3*　(.北京农学院植物科学技术学院，北京 006；.北京农学院生物科学与工程学院，北京 006；3.农业部都市农业(北方)重点开放实验室，北京 006)



大豆GmAGL8基因的克隆及生物信息学分析

李冉阳1， 秦玉涛1， 张 倩2， 吴 婧2， 谢 皓1， 郭 蓓2,3*(1.北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；2.北京农学院生物科学与工程学院，北京 102206；3.农业部都市农业(北方)重点开放实验室，北京 102206)

炸荚是大豆的一种自然属性，也是大豆生产中的一种不良现象，严重影响大豆收获产量。印度学者报道，在热带或亚热带地区，大豆易炸荚品种和中度炸荚品种的产量损失分别达57～175和0～186 kg/hm2[1]，国内学者研究表明，中度炸荚品种的产量损失约为112.5 kg/hm2[2]; 相关研究者也指出野生型及小粒大豆的炸荚现象尤为普遍[3-5]。世界范围内由于作物种皮开裂造成的农业产量损失很严重，因此控制种皮开裂对于提高农产品产量具有重要意义。

荚果 (pod)是由子房发育而来的果实，由通过背缝线和腹缝线相互连接的2个单心皮组成。大豆豆荚是荚果的一种。成熟的大豆荚沿着荚背缝线和腹缝线裂开，随后散出种子的现象称为炸荚(pod-shattering)[6]。当荚果的水分含量相对较低时，荚内生厚壁组织层细胞的张力不同，荚皮围绕着与内生后壁组织层的纤维方向平行的轴呈螺旋的扭转而卷曲，将连接背、腹缝线的薄壁组织拉裂，荚皮开裂[6-7]。

AGL8也被称作AGAMOUS-like8，FRUITFULL，FUL等。前人分别对拟南芥和桃中的相关基因进行了研究。结果表明，AGL8 基因既调控分裂组织的分化，又在随后的心皮发育中起调控作用[8-9]。根据前人研究，拟南芥FUL基因有影响拟南芥开花时间，维持花序分生组织特异性，控制花器官的发生、心皮的发育、角果的伸长等功能。在FUL众多作用中，最受关注的是FUL控制拟南芥角果果荚开裂的作用，过表达FUL导致其成熟角果的果荚不开裂[10]。这种表型对于许多农作物特别是十字花科植物，很有借鉴意义和应用价值。徐勇等[11]从桃树(Prunuspersica) 中克隆出与FUL同源的基因PpMADS6，研究发现，过表达的PpMADS6使拟南芥花期提前，单花器官数目增多 (如花瓣、心皮、雄蕊均有增多)，出现顶端花和多果荚角果在成熟期不开裂等性状。且过表达的PpMADS6使拟南芥果荚不开裂，暗示它与FUL行使相同功能，控制角果裂合处细胞的木质化，影响种皮开裂[11]。

笔者对大豆GmAG48基因的克隆及生物信息学进行分析，以期能够获得大豆中与炸荚相关的基因。

1材料与方法

1.1试验材料植物材料为大豆品种中黄10，由中国农业科学院作物科学研究所提供，北京农学院功能基因发掘与系统生物工程实验室繁育。克隆载体为pUC-T(康为世纪生物科技有限公司)。大肠杆菌菌株DH5α为北京农学院功能基因发掘与系统生物工程室留存。

1.2试验方法

1.2.1引物设计。根据相关文献报道，利用拟南芥角果开裂FUL基因及桃的PpMADS6基因，在大豆基因组中找到与之同源性高的GmAGL8基因(735 bp)。根据GmAGL8的mRNA序列，设计引物GmAGL8-F: 5′-GGAATTCCATGGGGAGAGGAAGGGTGC-3′;GmAGL8-R: 5′-GGGGTACCCCTATTCATTTGTAGGACGAAG-3′。

1.2.2目的基因的克隆。用Trizol法提取大豆中黄10的总RNA，反转录为cDNA，用上述引物进行PCR扩增。将扩增产物回收连接到pUC-T载体上，热激转化到大肠杆菌DH5α后进行序列测定。

1.2.3GmAGL8的生物信息学分析。在NCBI上将GmAGL8与其他物种进行同源性比对，使用DNAMAN构建进化树。分析GmAGL8基因的CDS。利用ExPASy进行氨基酸分子量、等电点计算。通过ProtParam软件，对GmAGL8基因编码的氨基酸组成进行分析。利用Protscale在线软件，对GmAGL8基因编码的氨基酸序列进行亲疏水性分析。

2结果与分析

2.1目的基因的克隆以大豆中黄10的cDNA为模板，以GmAGL8-F和GmAGL8-R为引物，进行PCR扩增，得到一条特异性的PCR扩增条带，其中1、3、4号样品条带与预期扩增条带(735 bp)大小一致(图1)。选取3号PCR产物与T载体连接为GmAGL8-T并转化大肠杆菌DH5α，通过菌落PCR鉴定出阳性克隆后进行序列测定。测序结果显示，克隆片段与GenBank上GmAGL8序列的相似度为99.86%，在735个碱基中有734个碱基序列完全相同，只在第549 bp处产生差错，A碱基错配成G碱基，但翻译产物没有变化，仍为丙氨酸。

2.2GmAGL8的生物信息学分析

2.2.1PpMADS6和FUL与大豆GmAGL8的比对。将桃中的PpMADS6和拟南芥中的FUL分别与大豆基因组上的GmAGL8进行比对后发现，大豆中的GmAGL8序列与拟南芥中的FUL相似度为77%，与桃中的PpMADS6相似度为80%。3个基因之间的氨基酸序列同源性为74%(图2)。研究表明PpMADS6与FUL同属于MADS box基因家族，对果实成熟及花器官发育起着调控作用，在拟南芥中有控制角果开裂的功能，由此推测，大豆中的GmAGL8也应该与豆荚开裂有关。

2.2.2基因进化分析。将GmAGL8在NCBI中进行Blast，找到与GmAGL8具有一定相似度的序列，从中挑选出相似值较高的比对序列，利用DNAMAN软件进行基因多重序列比对并构建进化树，结果见图3。从图3可以看出，大豆与菜豆、田青、鹰嘴豆及豌豆的进化关系比较密切，其中与菜豆的相似度最高。

2.2.3GmAGL8的氨基酸序列分析。大豆GmAGL8基因的735个碱基共编码244个氨基酸。通过ExPASy软件对其编码的氨基酸进行分子量及等电点分析发现，GmAGL8编码的氨基酸等电点(pl)的理论计算值为9.21，分子量(Mw)的理论计算值为27999.95。

利用ProtParam软件对GmAGL8基因编码的氨基酸组成进行了分析，其中含量最高的为亮氨酸(Leu)占12.3%，其次是谷氨酸(Glu)10.2%，赖氨酸(Lys)9.0%，谷氨酰胺(Gln)和丝氨酸(Ser)均占7.4%，精氨酸(Arg)7.0%，丙氨酸(Ala)6.6%，天冬酰胺(Asn)5.3%,，苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)各占4.9%，甘氨酸(Gly)和缬氨酸(Val)均占4.1%，脯氨酸(Pro)3.7%，天冬氨酸(Asp)3.3%，组氨酸(His)2.5%，酪氨酸(Tyr)和蛋氨酸(Met)均占2.0%，苯丙氨酸(Phe)1.6%，含量最少的为半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)各占0.8%，不含半胱氨酸(Sec)和吡咯赖氨酸(Pyl)。负电荷总数为33，正电荷总数为39，是一种带2个正电荷的蛋白。在原子组成方面，按所占比例依次为C∶1220、H∶2004、O∶377、N∶362、S∶7，原子总量为3 970。

2.2.4亲疏水性分析。使用ExPASy的Protscale在线软件，采用Kyte & Doolittle 算法对GmAGL8基因编码的氨基酸序列进行亲疏水性分析，结果见图4，疏水性最大峰值出现在第45个氨基酸上，峰值为2.089。亲水性最大峰值出现在第141个氨基酸上，峰值为-2.589。氨基酸在亲水性区域所占比重远大于疏水性区域，预测GmAGL8基因编码的蛋白为亲水性蛋白。

2.2.5GmAGL8的蛋白质结构。由图5可知，GmAGL8的CDS全长为735 bp。通过对其CDS区进行分析发现，第2～79个氨基酸编码一个与MADS具有相似功能的MEF2结构，推测其中第2～38个碱基处含有DNA结合位点，长度为37 bp；且在第59个氨基酸处还含有推测的磷酸化位点；在第21～74个氨基酸处含有多肽结合位点；在第75～167个氨基酸中间存在一个K-box基因，长度为93 bp，呈卷曲的螺旋结构，K-box与SRF-type转录调控有关系，很可能对多聚体的形成存在影响。

3结论与讨论

根据前人研究的结果，分别在拟南芥和桃中找到了控制果荚裂合的2个基因FUL和PpMADS6。利用NCBI将这2个基因分别与大豆基因组进行比对，结果在大豆基因组中查找到一个相似性较高的基因GmAGL8，其与拟南芥FUL基因相似度为77%，与桃的PpMADS6基因相似度为80%。研究表明，FUL和PpMADS6都有控制拟南芥角果果荚开裂的作用，当该基因过表达时，拟南芥角果果荚变短且成熟时不易开裂。由此推测，大豆中的GmAGL8基因或许是控制大豆豆荚开裂与否的有效基因之一。

此外，对GmAGL8基因进行相关生物信息学分析结果表明，GmAGL8中含有一个K-box基因功能区，推断其与多聚体的形成有关。同时发现，存在与MADS基因功能相似的MEF2。MADS-box基因家族有控制植物花器官分化、果荚裂合的功能，或许GmAGL8对大豆花和果实的发育也存在调控作用，且推断在第2～79 bp处基因编码的蛋白可能承担该功能。这些推测需要后续的试验加以证实。

通过亲疏水性分析发现GmAGL8基因编码的氨基酸多为亲水性氨基酸，其中含量最高的为亮氨酸(Leu)，含量最低的为半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)，且不含半胱氨酸(Sec)和吡咯赖氨酸(Pyl)。

通过基因多重序列比对及进化树构建发现，大豆与菜豆、田青、鹰嘴豆及豌豆的进化关系比较密切，其中与菜豆的相似度最高。

参考文献

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摘要通过同源扩增从大豆中克隆得到与拟南芥AGL8基因相似的基因GmAGL8，并对该序列进行了测定。同时对GmAGL8进行了生物信息学分析，通过比对GmAGL8与桃PpMADS6和拟南芥FUL的核酸序列，相似度分别为80%和77%，三者的氨基酸序列同源性为74%。通过亲疏水性分析预测GmAGL8基因编码的蛋白为亲水性蛋白。在GmAGL8中发现与MADS基因家族相似的MEF2并找到可能对多聚体的形成有关的K-box基因。

关键词大豆；GmAGL8； 炸荚；克隆；生物信息学

Cloning and Bioinformatics Analysis of GeneGmAGL8 in Soybean

LI Ran-yang1, QIN Yu-tao1, ZHANG Qian2, GUO Bei2,3*et al(1. College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 2. College of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 3. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing 102206)

AbstractBy comparing nucleotide sequences of GmAGL8 with peach PpMADS6 and arabidopsis FUL, similarity were 80% and 77% respectively, their amino acid sequences homology of 74%. GmAGL8 gene encoding proteins is hydrophilic proteins. In soybean GmAGL8, it was found a structure named MEF2 which is similar to MADS gene families and a gene named K-box might be in the formation of polymer.

Key wordsSoybean; GmAGL8; Pod-shattering; Cloning; Bioinformatics

收稿日期2015-04-30

通讯作者

作者简介李冉阳(1990- )，女，硕士研究生，研究方向：大豆分子遗传育种。*，教授，从事植物分子遗传育种研究。

基金项目国家高技术研究发展计划(863)项目(2012AA101106)。

中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)18-045-04