石渠棘球绦虫Es95基因克隆及序列分析

李建秋，李 立，闫鸿斌，娄忠子，贾万忠

(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)



石渠棘球绦虫Es95基因克隆及序列分析

李建秋，李 立，闫鸿斌，娄忠子，贾万忠*

(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)

包虫病(Echinococcosis)，又称棘球蚴病，是由棘球属绦虫的幼虫寄生于中间宿主体内引起的一种重要的人兽共患寄生虫病。该病呈世界性分布，给全球造成了严重的经济问题和公共卫生问题。棘球绦虫的成虫主要寄生于犬科动物(家犬、薮狗、狼、狐、豺狼、北貉及土狼)、猫科动物(狮、美洲狮、美洲虎及美洲山猫)和鬣狗科动物的小肠内，卵通过粪便排出体外，并污染周围环境。易感的中间宿主通过偶然食入虫卵而受到感染。人是棘球蚴非适宜性宿主，除特殊情况外在寄生虫生活史中不产生任何作用。然而，它们严重的发病率和致死率可引起重大的社会和经济问题。根据最新的分子及系统进化分析，棘球绦虫主要包括9个成员，即广义上的细粒棘球绦虫(E.granulosus)(包括E.granulosus的3个基因型G1～G3)，马棘球绦虫(E.equinus)(G4)，奥氏棘球绦虫(E.ortleppi)(G5)，加拿大棘球绦虫(E.canadensis)(G6～G10)，狮棘球绦虫(E.felidis)，多房棘球绦虫(E.multilocularis)，少节棘球绦虫(E.oligarthrus)，石渠棘球绦虫(E.shiquicus)及福氏棘球绦虫(E.vogeli)[1]。

1993年，第16届国际包虫病大会(北京)上，我国学者报道了在高原鼠兔肺脏上发现了细粒棘球绦虫包囊，高原鼠兔作为青藏高原上一种常见的啮齿类动物，且是多房棘球绦虫的中间宿主[2]。1995年，QIU等[3]在藏狐体内发现了石渠棘球绦虫的成虫，但当时认为是多房棘球绦虫的变异体。2005年，Xiao等[4]在四川省甘孜州石渠县从高原鼠兔肝脏分离出一种棘球蚴，其核苷酸序列与已知棘球绦虫的核苷酸序列差异十分明显，并根据该虫在形态学和分子生物学等方面的特征首次将其命名为石渠棘球绦虫。在此之前，由于其在形态上与多房棘球绦虫极其相似，一度认为是多房棘球绦虫的变异种，目前尚未发现石渠棘球绦虫感染人的病例。自1996年，Lightowlers等[5]首次在细粒棘球绦虫(新西兰羊株)六钩蚴cDNA文库筛选出6个克隆，免疫羊时发现6个克隆中保护效力最好的是EG95融合蛋白(保护率达96%～100%)以来，世界各地学者都进行EG95蛋白免疫保护性试验，均取得了理想的效果。而ES95作为EG95的同源蛋白，两者无论是氨基酸序列还是基因编码序列均具有很高的相似性，因此，笔者通过对ES95蛋白生物信息学分析，验证 ES95蛋白在预防包虫病上是否具有很大的潜力。

1材料与方法

1.1试验材料感染了石渠棘球绦虫的高原鼠兔采集于青海省果洛藏族自治州久治县哇尔依乡(100°20′～101°47′ E，33°02′～34°03′ N)；石渠棘球绦虫全基因组DNA于高原鼠兔肺脏上的石渠棘球蚴包囊中提取；全基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；T-Vector pMD18克隆载体购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2试验方法

1.2.1引物设计。从NCBI上下载6种棘球属绦虫95基因序列，这6种棘球属绦虫分别为E.granulosus(EU595909)、E.multilocularis(EU595927)、E.canadensis(EU595920)、E.oligarthrus(EU595938)、E.equinus(EU595921)和E.ortleppi(EU595913)，设计引物并送金唯智生物(北京)有限公司进行合成。

引物序列为ES95-F：5′ GAAGATGGCATTCCAGTTATGTCTC 3′，ES95-R：5′ GTTCAAGTAAGGACAACCACTATGC 3′。

1.2.2PCR扩增，将石渠棘球蚴包囊于液氮内迅速冷冻后研成粉末，按DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，然后按如下体系及程序进行PCR扩增，扩增体系为：2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μl，上下游引物各0.5 μl(25 μmol/L)，转录产物(cDNA)2 μl，加灭菌去离子水补至50 μl。

反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物纯化后，连接到T载体上，转化至DH5α内，PCR鉴定为阳性结果后送北京金唯智生物有限公司进行测序。

1.2.3生物信息学分析。 通过蛋白分析服务器ExPASY(http：//ca.expasy.org/)在线软件ProtParam(http：//web.exp asy.org/protparam/)和Proscale(http：//web.expasy.org/protscale/)对EM95的基本理化性质进行分析。

利用在线软件SignalP 4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对蛋白质信号肽进行预测；利用在线软件TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对EM95跨膜区进行预测。

通过蛋白分析服务器ExPASY在线软件PredictProtein(https：//www.predictprotein.org/)预测蛋白质的二级结构。

利用CBS平台上的BepiPred 1.0b(http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)和DNAStar两者结合方式预测抗原表位。

2结果与分析

2.1石渠棘球绦虫Es95基因的克隆以Es95基因特异性引物进行扩增，用1%琼脂糖进行电泳，结果得到1 330 bp的特异性条带，与预期大小一致，证明已成功扩增到该基因(图1)。

2.2石渠棘球绦虫Es95基因结构通过与Eg95、Em95序列比对Es95基因有3个外显子和2个内含子，利用MotifScan在线软件预测出ES95蛋白全长为156个氨基酸，含有1个糖基化位点(图2)。

2.3Es95基因的理化性质ES95蛋白由20种氨基酸组成，其中，Leu含量最多(12.8%)，His和Trp含量最少(0.6%)。ES95蛋白的理论分子质量为17.11 ku，等电点为8.58，带电荷残基30个，其中负电荷残基14个(8.97%)，正电荷残基16个(10.26%)。原子组成为C768H1245N207O197S7。不稳定系数为34.39，证明该蛋白质相对较为稳定。蛋白在哺乳动物网状细胞体外培养中表达的半衰期为30 h，在酵母中表达的半衰期大于20 h，在大肠杆菌中表达的半衰期大于10 h。脂肪族氨基酸指数为97.50，总平均亲水性为0.146，蛋白总体亲水性较低。

2.4ES95信号肽及跨膜区预测ES95长为156个氨基酸，既含有信号肽序列又包括跨膜区。其中第1～16个氨基酸为信号肽序列，第1～132个氨基酸为胞外区，第133～156个氨基酸为跨膜区(图3)。

2.5ES95二级结构分析通过对该ES95蛋白二级结构的预测，结果显示，二级结构中柔性结构占氨基酸总数的51.29%，其中α-螺旋(H)和β-折叠(E)分别占8.33%和43.59%，无规则卷曲(L)占48.08%(图4)。

2.6抗原表位预测BepiPred 1.0b预测的ES95蛋白具有抗原性的抗原表位有：第19～32位，第59位，第69～77位，第94位，第96～97位，第121～134位，第137～138位。而用DNAStar所预测的具有抗原性的抗原表位有：第17～36位，第57～65位，第68～82位，第92～101位，第103～113位，第116～133位(图5)。综合两者分析，确定ES95蛋白B细胞抗原表位有：第19～32位，第69～77位，第96～97位，第121～133位。

3结论与讨论

Es95基因全长1 330 bp，包括3个外显子和2个内含子，两端外显子较短，而中间外显子较长，编码区长471 bp，编码156个氨基酸。ES95蛋白是石渠棘球绦虫重要的保护性抗原，在六钩蚴钻出肠壁时起重要作用。随着分子生物学技术及计算机的发展，生物信息学技术广泛应用，利用计算机辅助疫苗设计技术得以飞速发展。利用一些在线或者是本地的生物信息学软件对基因或蛋白序列进行分析，不仅可以清楚地表明蛋白的基本性质，而且很直观地得到该蛋白的特殊结构，为蛋白是否有成为疫苗分子的潜力或者怎样设计才能具有更好的免疫效果提供了便利条件，而且操作简单、迅速、直观。Hoop等[6]在1981年提出了用蛋白质亲水性参数预测抗原表位的方案，推动了B细胞抗原表位的研究。1985年，Karplus等[7]为进一步提高抗原表位预测的准确性，提出了蛋白质柔韧性区域的预测，认为蛋白质骨架具有一定的活动性，其活动性强弱可以预测抗原表位。随后，Jameson等[8]提出的氨基酸残基统计分析和以隐马尔科夫模型建立的抗原表位预测方法都能很好地预测抗原表位，而多种方法相结合可以使预测结果更加准确。

该研究从多房棘球绦虫的幼虫多房棘球蚴全基因组中扩增出Es95完整的编码基因，并对其生物信息学特性进行预测与分析。将测序结果与NCBI上Eg95和Em95序列比对发现三者相似性很高。预测的ES95分子质量与EM95大小相似，比EG95略大一些，分子质量约为17.1 ku，有一个糖基化位点，糖基化是真核生物在蛋白翻译后一种重要的修饰方式。ES95、EG95和EM95三者理化性质非常相似，均在N端有一个长为16个氨基酸的信号肽序列，在C端具有一个长为23个氨基酸的跨膜区，碱性蛋白质，其中EM95蛋白的碱性最强，亲水性都较低。对其二级结构和三级结构分析可以看出α-螺旋结构所占比例较低，主要是以β-折叠结构为主。结合BepiPred 和DNAStar两者对B细胞抗原表位分析发现，ES95含有4个抗原表位，而李玉娇等[9]对EG95抗原表位预测分析发现EG95可能存在7个B细胞抗原表位(第16～38位，第41～48位，第50～67位，第68～90位，第92～100位，第103～113位，第120～132位)，范彦雷等[10]对EM95抗原表位预测分析发现EM95可能存在6个B细胞抗原表位(第17～35位，第42～64位，第69～90位，第92～100位，第105～121位，第124～139位)，从上述结果来看，ES95蛋白的抗原表位与EM95和EG95相差较大，但用BepiPred软件预测EG95、EM95抗原表位的结果与上述结果有所差别，EG95潜在的抗原表位只有5个，分别为第20～32位，第41～44位，第69～77位，第82～86位，第120～134位，而EM95潜在的抗原表位则有6个，分别为第19～21位，第25～33位，第69～77位，第81～86位，第107～111位，第127～134位。这种预测方式则使ES95与EG95、EM95预测结果相差不大，主要是第41～44位和第82～86位的差别，但无论哪种结果EG95和EM95抗原表位所包含的氨基酸数比ES95要多。这种差别可能会使得ES95在抗原动物保护力上要低于EG95和EM95，而且氨基酸残基极性与非极性的替换也会给蛋白质的空间结构造成很大的影响。该研究对石渠棘球绦虫Es95基因进行了分析，为进一步研究石渠棘球蚴的生物学功能、开发理想的ES95抗原疫苗奠定了理论基础。

参考文献

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[2] GUO Z X，HE D L，LI Y Q，et al.Survey of endemic situation and natural foci of hydatidosis in Qinghai-Tibet plateau[J].Int Arch Hydatid，1993，31：69.

[3] QIU J M，CHEN X W，REN M，et al.Epidemiological study on alveolar hydatid disease in Qinghai-Xizang plateau[J].J Pract Parasit Dis，1995，3：106.

[4] XIAO N，QIU J M，NAKAO M，et al.Echinococcusshiquicusn.sp.，a taeniid cestode from Tibetan fox and plateau pika in China[J].International Journal for Parasitology，2005，35(6)：693-701.

[5] LIGHTOWLERS M W，LAWRENCE S B，GAUCI C G，et al.Vaccination against hydatidosis using a defined recombinant antigen[J].Parasite Immunology，1996，18(9)：457-462.

[6] HOOP J P,WOOD K R.Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences [J]. Immunology,1981,78(6):3824-3828.

[7] KARPLUS P A,SCHULZ G E.Prediction of chain flexibiligy in proteins [J].Naturwissenschaften, 1985 ,72(4) :212-213.

[8] JAMESON B A,WOLF H.The antigenic index: A novel algorithm for predicting antigenic determinants[J]. Computer Applications in the Biosciences : CABIOS,1988, 4:181-186.

[9] 李玉娇,王晶,赵慧,等.细粒棘球绦虫Eg95 抗原表位的生物信息学预测[J].中国人兽共患病学报,2011,27(10):892-896.

[10] 范彦雷，李立，娄忠子，等.多房棘球绦虫EM95 蛋白的生物信息学分析[J].中国人兽共患病学报，2014，30(4)：423-428.

摘要[目的]首次克隆获得石渠棘球绦虫Es95基因，并进行序列分析，为研究抗包虫病候选疫苗提供理论指导。[方法]从高原鼠兔肺脏包囊上获得石渠棘球绦虫原头蚴，提取全基因组，并根据NCBI上6种棘球属绦虫95基因序列设计引物，以基因组DNA为模板扩增到Es95基因，并克隆到T载体上，测序后进行序列分析。[结果]以石渠棘球绦虫全基因组DNA为模板扩增出Es95基因长为1 330 bp，序列分析含有3个外显子和2个内含子，有1个糖基化位点，N端有一信号肽序列(16个氨基酸)，C端有跨膜区(23个氨基酸)，亲水性低，B细胞抗原表位预测有ES95潜在抗原表位6个。[结论]ES95是一个分泌性糖蛋白，在包虫病的预防上具有重要意义。

关键词石渠棘球绦虫；ES95蛋白；序列分析

Cloning and Sequence Analysis ofEs95 Gene fromEchinococcusshiquicus

LI Jian-qiu, LI Li, YAN Hong-bin, JIA Wan-zhong*et al(State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, CAAS, Lanzhou, Gansu 730046)

Abstract[Objective] The Es95 gene was cloned from E. shiquicus, the sequence analysis was conducted, which will provide theoretical guidance for candidate vaccine in anti-Echinococcosis. [Method] 6 nucleotide sequences of Echinococcus 95 genes download from NCBI were used as reference sequence for designing primers and then was amplified with PCR from total DNA as the template. The Es95 was cloned into vector T and sequenced. [Result] After sequenced, it was found that the length of complete Es95 gene was 1 330 bp, bioinformatic software was used for analyzing the ORF of Es95 and found that it had 3 exons and 2 introns. ES95 was a secreted protein, with one glycosylate sites, a 16-residue signal peptide in N-terminal and a 23-residue trans-membrane region. The analysis of B-cell eptitopes indicated that the ES95 has 6 potential antigen eptitopes. [Conclusion] ES95 was a secreted protein, with one glycosylate sites, it may played a great role in anti-Echinococcosis.

Key wordsEchinococcus shiquicus; ES95 protein; Sequence analysis

收稿日期2015-04-30

作者简介李建秋(1989- )，女，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：人兽共患病及公共卫生学。*

通讯作者，研究员，博士，博士生导师，从事人兽共患病及公共卫生学研究。

中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)18-033-04