MB-EMBA和ASCA方法在玉米/马铃薯生长期根际微生物多样性动态数据分析中的运用

毛如志，王文鹏，何霞红　(农业生物多样性应用技术国家工程研究中心，云南农业大学，云南昆明 650201)



MB-EMBA和ASCA方法在玉米/马铃薯生长期根际微生物多样性动态数据分析中的运用

毛如志，王文鹏，何霞红*(农业生物多样性应用技术国家工程研究中心，云南农业大学，云南昆明 650201)

间作模式是西南山区最重要的模式。间作对作物的效应聚焦在作物的地下部分和地上部分，其中地下部分根际微生物的多样性及动态过程对作物的生长、产量形成具有重要贡献，是间作生态中的重要问题。间作体系下各作物根际微生物不同时间节点多样性的变化趋势和关键因子的鉴定，对发现环境及栽培模式对土壤和根际微生物群落的动态影响重要意义。多种分子生物技术及化学分析法应用于根际微生物多样性的分析，其中PCR-DGGE(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis)是定量和定性微生物物种多样性的有效方法之一。Biolog ECO是定量和定性微生物活力代谢多样性的重要方法[1-3]。深入分析环境微生物多样性的数据结构、规律，对解释间作效应有科学意义。PCR-DGGE和Biolog ECO采集到的根际微生物群落数据分为静态数据及动态数据。目前，大多数研究采用静态分析法。多元变量方法常用于DGGE 和Biolog ECO静态数据分析[3-7]。但是，静态分析法有无法克服的缺陷。首先，由于目前微生物的复杂性，采用的静态分析法无法揭示微生物变化的规律及对土壤微生态的调控过程；其次，动态数据数据量大，影响因素复杂，目前的分析技术难以从数据找到相应的规律。所以，静态多元变量分析技术无法揭示DGGE 和Biolog ECO 动态数据规律。动态数据分析法MB-EMBA(Multivariable-empirical method bayies analysis)和ASCA(ANOVA simultaneous component analysis)在生物组学研究中有少量应用。DGGE和Biolog ECO数据类似于生物组学，因此采用MB-EMBA、ASCA分析玉米与马铃薯间作种植模式下根际微生物多样性的差异，从中鉴定关键因子，揭示环境与间作模式间的互作关系[6，8-11]。这对农业生产实践及理解间作机理具有科学意义。

1材料与方法

1.1土壤取样试验设置在云南省昭通市昭阳区(1 844 m，27°48′N，103°45′E，降雨量900 mm)及鲁甸县(1 904 m，27°8′N，104°85′E，降雨量852 mm)。供玉米品种为云瑞-9409(Zeamayssubsp.Mays)；供试马铃薯品种为会-2(Solanumtuberosum. L)。试验设置3个处理：①马铃薯净作；②玉米马铃薯间作；③玉米净作。采用五点取样法，每点选择10株玉米和马铃薯；分别在种植前、种植后85、130、160、185 d取玉米和马铃薯根际土壤样品，重复3次，每个点取5份。对于用于Biolog ECO分析的土壤样品，应以最快速度置于4 ℃冰箱保存；对于用于DGGE分析的土壤样品，应用1.5 ml离心管装好，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2土壤理化性质种植前，对土壤理化性质进行测试。昭通市昭阳区pH 6.38，碱解氮94 mg/kg，可溶性磷 7.8 mg/kg，可溶性钾158 mg/kg，有机质18.2 g/kg；鲁甸县pH 5.90，碱解氮113 mg/kg，可溶性磷3.9 mg/kg，可溶性钾118 mg/kg，有机质17.0 g/kg。

1.3田间管理不使用任何农药进行病害防治。种植前，使用农家肥 7.5 t/hm2(pH 6.77、碱解氮2 337 mg/kg、可溶性磷7.6 mg/kg、可溶性钾45.78 mg/kg、有机质 400 g/kg)，尿素(0.15 t/hm2)，磷(0.45 t/hm2)，钾(0.09 t/hm2)。

1.4基质利用的评价采用Biolog ECO(Biolog.Inc.CA)平板作为基质。平板培养、数据读取参照方法。获得的数据选择120 h进行多元变量分析[3]。

1.5土壤DNA的提取及PCR-DGGE土壤DNA采用百泰克试剂盒(E.Z.N.A.®Soil DNA Kit)提取，操作按照试剂盒说明书进行。用浓度1.2%琼脂糖凝胶确认DNA片段大于23 kb，OD260/2801.40～1.60，OD260/2301.5～1.60。采用Touchdown-PCR 方法进行扩谱。PCR反应体系50 μl 。其中，25 μl 2× Master Mix(生工)，21.50 μl ddH2O，0.5 μl 牛乳血清蛋白，1 μl 341F-GC(生工)，1 μl F314-5′GC(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGG-GCGGGGGCACGGGGGGCCTACG-GGAGGCAGCAG3′)，534R(5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′[2]，1 μl DNA模板。扩谱程序为94 ℃变性8 min；50～60 ℃延伸1 min，10循环；72 ℃延伸1 min，然后94 ℃变性1 min，50 ℃延伸1 min，25个循环；72 ℃延伸11 min；72 ℃保持7 min；4 ℃保存。100 μl PCR产物用Bio-Rad旋蒸仪浓缩5～6倍，Bio-Rad 的Dcode突变检测系统灌制30%～65%梯度胶。其余过程参照Bio-Rad说明书进行。

1.6数据分析Quantity One-4.6.2 software(Bio-Rad，CA，USA)DGGE 图谱定性，MetaboAnalyst3.0 时间序列分析[12-14]。净作记作Type 0，间作记作Type 1，取样次数记作0(85 d)、1(130 d)、2(165 d)、3(185 d)。MB-EMBA方法采用Hoteling-T2的数值来定量。

环境对种植方式的影响=ASCA PC1(A环境条件)- PC1(B环境条件)

2结果与分析

2.1DGGE结果分析由图1可知，各时期及各处理条带的亮度位置均有差异。从图中可观察到明显的共有条带，但条带在每个时期的迁移位置不同，说明每个时期的细菌群落具有多样性，不同时期群落结构不同。不种作物的空白对照微生物种类少，多样性低；玉米与马铃薯根际微生物样品多样性高于对照。

2.2Biolog ECO数据MB-EMBA分析由表1可知，不同试验点玉米单间作根际微生物在不同生育时期对碳源利用的差异明显。与单作相比，静安玉米间作根际微生物利用较高的碳源为D-苹果酸、腐胺、L-苏氨酸、酸-γ-内酯、4-羟基苯甲酸、D-半乳糖酸-1，4-内酯、环糊精、苯基乙胺；鲁甸间作根际微生物利用的碳源为D-苹果酸、4-羟基苯甲酸、吐温 40、吐温80、丙酮酸甲酯、D-甘露醇、L-精氨酸、纤维二糖、苯基乙胺、纤维二糖、腐胺、衣康酸、D-半乳糖酸-1，4-内酯、D-半乳糖醛酸；两试验点间作改变根际微生物利用的碳源为D -苹果酸、腐胺、苯基乙胺、4-羟基苯甲酸、D-半乳糖酸-1，4-内酯。与单作相比，静安马铃薯间作根际微生物利用较高的碳源为L-精氨酸、糖原、吐温80、β-甲基-D-葡糖、D-苹果酸、环糊精、 赤藓糖醇、D-甘露醇、L-丝氨酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、衣康酸、2-丁酮酸、纤维二糖、D木糖、丙酮酸甲酯；鲁甸间作根际微生物利用的碳源为α-D-乳糖、糖原、4-羟基苯甲酸、吐温80、L-丝氨酸、D-苹果酸、天冬酰胺、D-半乳糖醛酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖；两实验点间作改变根际微生物利用的碳源为赤藓糖醇、苯基乙胺、吐温80、L-丝氨酸、D-苹果酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。马铃薯间作根际微生物利用的碳源种类多于玉米间作根际微生物利用的碳源种类。

2.3Biolog ECO和 DGGE数据的ASCA分析Biolog ECO数据ASCA分析表明，玉米单作和间作在两个试验点主成分1比主成分2重要，在玉米生长期1、2、3时间节点间作玉米根际微生物的活力高于单作，静安主成分1为 45.29，鲁甸主成分1为72.63，环境影响占27.34(图2a、2b)。DGGE数据分析结果表明，在玉米生长期1、2、3时间节点，间作玉米根际微生物的活力高于单作，静安主成分1为59.75，鲁甸主成分1为56.81，环境影响占2.94(图3e、3f)。因此，不同环境对玉米单作与间作根际微生物代谢活力大于细菌群落多样性。马铃薯单作和间作在两个试验点。Biolog ECO数据表明，在马铃薯生长期，间作马铃薯生长旺盛时期根际微生物在不同的环境下作用相反(图2c、2d)。DGGE数据分析结果表明，在2、3时间节点，间作马铃薯微生物的活力高于单作，静安主成分1为41.47，鲁甸主成分1为65.02，环境影响占23.55(图3f、3g)。因此，不同环境对马铃薯单作与间作根际微生物有影响。矮杆作物马铃薯受到玉米、环境的影响。在不同的环境条件下，根际微生物代谢活力和细菌群落多样性表现的趋势不同。

表1　MB-EMBA Hoteling-T2的结果

3结论与讨论

时间序列分析是一种多元变量分析，目前在生物组学数据分析中已有运用实例，主要分析生物在不同时期及环境互作下代谢组、转录组、蛋白组的变化规律[6，8-11]。采用时间序列(MB-EMBA、ASCA)分析DGGE和Biolog ECO动态数据，能够从时间角度对生物规律进行研究，确定其趋势。MB-EMBA从Biolog ECO数据中筛选出重要的碳源，但难以从DGGE数据筛选出重要的微生物类型。ASCA应用于Biolog Eco数据及DGGE数据，发现玉米净间作根际微生物在不同生育时期对碳源利用差异明显，马铃薯间作根际微生物利用的碳源种类多于玉米间作；不同环境对马铃薯单作与间作根际微生物有影响，矮杆作物马铃薯受到玉米、环境的影响，在不同的环境条件下根际微生物代谢活力和细菌群落多样性不同。有研究表明，间作提高微生物活力及多样性，而且缺少整个生育期的数据支持[12-19]。有的研究以生长高峰期或收获期的样本进行分析。另有研究以幼苗期为研究对象。这些研究缺少系统性和动态性，对于高杆作物/矮杆作物间作系统中矮杆作物生长空间、光能捕获受到限制。这可能是微生物多样性易受干扰的原因之一，而高杆作物捕获更多光能、生长空间，在不同环境条件下都能增加微生物的多样性。另一方面，时间序列(MB-EMBA、ASCA)与PLS(最小二乘法)等相关衍生方法及传统PCA相比，对DGGE和Biolog ECO数据分析更具有优势。PLS、PCA只能很好地解释静态数据包含的生物特征信息。过去的研究方法主要是采用多因数方差分析或单因数方差分析，或采用静态数据的多元变量分析方法。分析结果只能解释某一个生育期或环境条件下微生物的群落结构特征，无法系统地了解作物根际动态过程及微生物种群扮演的角色[3，20]。与其他方法相比，时间序列分析能全面获取环境、栽培模式互作对根际微生物的代谢活力及种群多样性的信息。研究表明， MB-EMBA更适合代谢群落多样性的关键碳源筛选，不适合DGGE关键细菌多样性的筛选。ASCA发现环境、栽培模式对根际微生物群体的影响，尤其是对DGGE和Biolog ECO的动态数据。分析结果很好地解释间作、环境的影响，因此时间序列(MB-EMBA、ASCA)在微生态动态数据分析中具有应用价值。MB-EMBA、ASCA可作为微生物代谢群落及细菌多样性动态数据的分析方法。微生态研究中可采用时间序列监测微生物变化动态及重要群落的筛选。在玉米与马铃薯间作系统中，高杆作物玉米在不同的环境下都增加微生物的多样性，矮杆作物马铃薯根际微生物代谢活力和细菌群落多样性易受环境的影响。

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摘要在农作系统中，深入分析环境、栽培模式对根际微生物多样性的数据结构及其规律的影响，对解释间作效应有科学意义。研究中，运用时间序列模型MB-EMBA和ASCA可以解析玉米/马铃薯生长期根际微生物多样性动态数据。结果表明，MB-EMBA、ASCA可以很好地解释环境与间作对根际微生物代谢群落及细菌物种多样性的影响。MB-EMBA方法分析表明，对Biolog动态数据，玉米单间作根际微生物在不同生育时期对碳源利用的差异明显，可在不同的试验点筛选出碳源标记，马铃薯间作根际微生物利用的碳源种类多于玉米间作根际微生物利用的碳源种类。ASCA结果表明，高杆作物玉米单间作每个时期差异都在0.05水平显著，在玉米生长期1、2、3时间节点间作玉米根际微生物的活力、物种多样性高于单作，在不同环境条件下玉米单作与间作根际微生物代谢活力大于细菌群落多样性；马铃薯单间作根际微生物代谢群落及细菌多样性比较复杂，矮杆作物马铃薯更易受玉米、环境的影响。因此，MB-EMBA和ASCA分析可为解析生物动态数据分析提供新思路。

关键词动态数据；MB-EMBA；ASCA；根际微生物代谢群落；细菌群落多样性

Employed MB-EMB and ASCA Methods to Analyze Maize/Potato Growth Period’s Rhizosphere Microbial Biodiversity Dynamic Datas

MAO Ru-zhi, WANG Wen-peng, HE Xia-hong*(National Center for Agricultural Biodiversity, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201)

AbstractTo study the influence of environment and cultivation mode on rhizosphere microbial dynamic data structure and trends were useful in agriculture systems to explain the effects of intercropping. In this research, using time series model MB-EMBA and ASCA to analyze maize/potato growth period’s rhizosphere microbial diversity dynamic data. The results showed that MB-EMBA, ASCA could better indicated of the environment and intercropping on rhizosphere microbial metabolism community and species diversity of bacteria, MB-EMBA analysis showed, for Biolog dynamic data, maize rhizosphere microbial carbon source utilization were different with growth periods, also screened out several carbon source markers，, intercropping potato rhizosphere microbial utilization of carbon sources more than intercropping maize; ASCA results showed that maize in 1, 2, 3 time node of growth period, the activity of microbial and species diversity of intercropping maize were more than monoculture. Potato rhizosphere microbial metabolic diversity and bacteria community were more complex, easier influenced by the environment. Therefore, the analysis of MB-EMBA and ASCA provide new ideas and alternative methods to analyze biological dynamic data.

Key wordsDynamics data; MB-EMBA; ASCA; Rhizosphere microbial community metabolism; Bacterial species diversity

收稿日期2015-04-29

通讯作者

作者简介毛如志(1986- )，男，云南昆明人，博士研究生，研究方向：土壤微生物生态。*，教授，博士，从事农业生物多样性与作物病害控制方面的研究。。

基金项目973项目(2011CB100400)。

中图分类号S 154.3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)18-001-04