2种harpin内源表达对短短芽孢杆菌HAB—5菌株抑制和促生能力的影响

2016-01-27汪惠谢琳琳刘文波等

江苏农业科学 2015年11期

汪惠　谢琳琳　刘文波等

摘要：采用化学方法分别将来自水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、棉花角斑病菌（X. citri subsp. malvacearum）hrp基因簇中的hpa1Xoo、hpaXm基因转化至生防菌短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株，测定2种harpin蛋白对短短芽孢杆菌抑菌和促生能力的影响，以期获得更高效的生防菌株。结果表明，获得转入hpa1Xoo的突变体581个，转入hpaXm的突变体有650个；经PCR及PCR Southern Blot验证，确定hpa1Xoo、hpaXm基因均成功转化至HAB-5菌株中；经SDS-PAGE电泳，在分子量大小约39、41 ku处可见明显条带，表明hpa1Xoo、hpaXm基因分别编码的融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm在突变体菌株中得到表达；与出发菌株HAB-5菌株相比，转化后的突变体在菌落形态、拮抗活性上均发生了改变，且突变体总蛋白可在烟草叶片上激发过敏性反应，而HAB-5菌株总蛋白不能激发过敏性反应；突变体菌株对番茄种子的促生作用显著提高，且转入hpaXm基因的菌株效果更佳，使胚芽、胚根的生长分别提高100.77%、69.14%。可见，harpin能够在短短芽孢杆菌HAB-5菌株中得到表达，且转化后的突变体表现出良好的促生效果。

关键词：hpa1Xoo；hpaXm；转化；短短芽孢杆菌HAB-5；过敏性反应

中图分类号： S476文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0161-06

收稿日期：2015-01-25

基金项目：国家自然科学基金（编号：31160359、31360029）；海南省产学研一体化专项（编号：CXY20140038）；海南大学社会服务专项（编号：HDSF201305）；教育部博士点基金（编号：20124601110004、20104601110004）；国家农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-34-GW8）；国家重大基础研究计划（编号：2011CB111612）。

作者简介：汪惠（1991—），女，硕士研究生，主要从事微生物学研究。

通信作者：郑服丛，教授，主要从事植物病理学研究。E-mail：zhengfucong@126.com。harpin是一类由革兰氏阴性植物病原细菌hrp基因编码的蛋白质，由不依赖信号肽的Ⅲ型分泌机制分泌到胞外，可在非寄主植物上引起过敏反应（hypersensitive response，HR）[1-3]。在非寄主植物上施用Harpin蛋白，可使植物产生抗病、抗虫、促进生长等多种有益表型[4]，这些表型与harpin蛋白诱导的植物内在生理生化反应相关[5]。harpin蛋白富含甘氨酸，缺乏半胱氨酸，热稳定但对蛋白酶敏感[6]。harpinXoo、harpinXm是由分别来自于水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、棉花角斑病菌（X. citri ssp. malvacearum）hrp基因簇中hpa1（hrf1）基因编码的蛋白，均具有harpin蛋白的共同特征，且能诱导烟草、拟南芥、番茄、矮牵牛、马铃薯、大豆、黄瓜、辣椒等多种植物产生过敏性反应[7-8]。

芽孢杆菌作为一种较理想的生防微生物，逐渐成为近年来研究的热点[9]。通过基因工程技术有目的地改造拮抗细菌，拓宽新型高效生防菌的防治范围并提高生防效果，已成为植物病害生物防治研究的重点[10]。目前，已有学者将编码harpin蛋白的hrp基因转入枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中，使出发菌株具有harpin蛋白的部分特性[11-12]。以短短芽孢杆菌作为表达系统是研究热点，但其表达harpin蛋白却未见报道。短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株是一种较广谱的生防细菌，对多种病原菌表现出较强的抑制能力，但该菌株不具有诱导抗病能力和稳定有效的促生效果[13]。把编码harpin蛋白诱导植物系统抗性的hrp基因转化到生防菌芽孢杆菌中，以期实现harpin蛋白在短短芽孢杆菌中的高效表达，获得更高效的生防菌株，为新型生物农药的开发利用提供基础。

1材料与方法

1.1供试菌株、培养基、植物材料

供试菌株为HAB-5菌株，是笔者所在实验室从棉花根际土壤中分离获得的1株短短芽孢杆菌[13]。大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BL21（DE3）作为重组融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm表达的宿主菌株，具有氨苄青霉素抗性（Amp，100 mg/mL），表达的重组融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm的分子量大小分别为39、41 ku左右。芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）C7-2菌株来自笔者所在实验室，用于拮抗测定。

LB培养基[14]用于HAB-5菌株、突变体菌株的培养；PDA培养基[14]用于供试病原真菌、HAB-5菌株、突变体菌株的对峙培养。MD培养基[15]（10 mL）配方为：10×PC缓冲液0.92 mL、50%葡萄糖0.1 mL（115 ℃灭菌30 min）、5 mg/mL 色氨酸0.1 mL、2.2 mg/mL柠檬酸铁铵0.005 mL、05 mol/L天门冬氨酸钾0.24 mL、1 mol/L硫酸镁0.03 mL。10×PC缓冲液配方为：磷酸二氢钾44 mmol/L、磷酸氢二钾60 mmol/L、柠檬酸三钠30 mmol/L。

供试烟草品种为三生烟（Nicotiana sp.），于（25±1） ℃培养至5～7叶。番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）种子红粉佳人，购自天津科润农业科技股份有限公司。

1.2酶、试剂、引物

质粒提取试剂盒、DNA Marker、Taq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司，Southern杂交试剂盒购自美国罗氏公司，分子操作过程均按说明书进行。引物合成、测序均由华大基因公司完成，引物序列见表1。PCR反应体系（总体积25 μL）为：EcoTaq Mix 8.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL，并使用灭菌超纯水补足至25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 45 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，保存图像。

1.4HAB-5菌株、突变体菌株的菌落形态及其对C7-2菌株的拮抗作用

1.4.1菌落形态观察用灭菌后的牙签接菌在LB琼脂平板上，置于28 ℃培养2 d，观察菌落形态。

1.4.2对芒果炭疽菌C7-2菌株的拮抗作用采用平板对峙法[16]，在PDA平板中央接种1块直径为0.5 cm的病原菌菌饼，在菌饼周围2.5 cm处接种供试细菌；单独接种直径为0.5 cm的病原菌菌饼为对照。将平板置于28 ℃下培养，观察记录有无抑菌圈及其大小，并计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照病原菌菌落直径×100%[17]。

1.5粗蛋白的提取及SDS-PAGE电泳

参照缪卫国提取harpin粗蛋白、菌体总蛋白的方法[8]，采用LB液体培养基振荡培养（160 r/min、28 ℃）菌株12 h，以8 000 r/min下离心10 min收集菌体。将菌体用PBS悬浮，经超声波破碎仪破碎菌体后于4 ℃、8 000 r/min离心10 min。采用0.22 μm细菌过滤器过滤上清液，获得粗蛋白，煮沸（100 ℃）10 min进一步纯化粗蛋白以检测harpin蛋白的活性。SDS-PAGE电泳参照汪家政等的方法[18]进行。

1.6烟草过敏性反应及突变体蛋白特性

过敏性反应的测定参照Klement的方法[19]，分别取HAB-5菌株的总蛋白、突变体代表菌株的总蛋白、GST-harpinXoo蛋白、GST-harpinXm蛋白、PBS各50 μL，注射到烟草叶片中，于（25±1） ℃下放置，观察烟草叶片是否发生过敏性反应。突变体蛋白特性的研究参照谌晓曦等的方法[20]，分别测定菌体粗蛋白在煮沸10 min、强酸碱、蛋白酶K、紫外线等处理下的稳定性。

1.7短短芽孢杆菌HAB-5菌株及其突变体菌株对番茄种子的促生作用

取HAB-5菌株、突变体代表菌株，测试其对番茄种子的促生作用。取摇菌过夜的菌株培养液，于4 ℃、8 000 r/min下离心10 min，弃去上清液。经无菌水清洗后再次离心，并用无菌水调节至D600 nm=0.8，即菌液浓度约为10 亿CFU/mL，保存备用。采用无菌水将各菌株菌悬液依次稀释为1亿、0.1亿、0.01亿、0.001 亿CFU/mL等浓度，每个处理浓度3次重复，每个重复10粒番茄种子。种子经温汤浸种后，置于铺有单层滤纸的培养皿（9 cm）中，分别向各培养皿中注入5 mL不同浓度的处理液，种子上部再铺1层滤纸，置于（28±1） ℃恒温培养箱中。于72 h后观察发芽势情况，于96 h后计算发芽率，并测定胚根、胚芽的长度，以根长达到0.2 cm为萌芽标志[21]。试验中对照均为无菌水。

2结果与分析

2.1突变体菌株的筛选及PCR、PCR Southern Blot验证

将hpa1Xoo、hpaXm基因转化HAB-5菌株48 h后，在Amp抗性平板上形成单菌落，作为阳性转化子，分别获得转入hpa1Xoo、hpaXm的转化子581、650个（图1-A）。挑取50个阳性转化子进行PCR验证，发现在400～500 bp间均可扩增出特异性条带，经测序比对分别与hpa1Xoo、hpaXm基因序列吻合。其中10个突变体的电泳结果见图1-B，分别将转入hpaXm的

突变体命名为B1xm、B2xm、B3xm、B4xm、B5xm，将转入hpa1Xoo的突变体命名为B1xoo、B2xoo、B3xoo、B4xoo、B5xoo。进行PCR Southern Blot验证以确保试验的精确性，可见选取的突变体均产生明显阳性信号（图1-C），由此确定hpa1Xoo、hpaXm基因均已成功转化至HAB-5菌株中。

2.2菌落形态对比

转化后的突变体在固体LB培养基平板上接种72 h，与HAB-5菌株相比，转入hpa1Xoo、hpaXm基因的突变体菌落均发生了一定程度的形态变化。HAB-5菌株的菌落呈白色，菌落表面微起皱褶，菌苔边缘呈波纹状，不透明，易挑起；转化后突变体的菌落颜色各异，呈白色或微黄色，菌落表面凸起，半透明且有光泽，质地湿润，不易挑起。转hpaXm菌株的菌落较平滑，菌苔边缘较整齐；转hpa1Xoo菌株的菌落多呈蛋黄状，中心凸起，边缘较平坦，菌苔边缘多呈不规则状（图2）。

2.3突变体对炭疽病C7-2菌株的拮抗作用

对峙培养后，HAB-5菌株及各突变体菌株在培养3、5、7 d 后均对病原菌C7-2菌株产生不同程度的抑制作用，但与HAB-5菌株相比，突变体的拮抗活性均减弱。对峙3 d后产生抑菌带；对峙5 d后抑菌带逐渐减弱，但抑菌效果有所增强；对峙7 d后抑菌带消失，但对病原菌仍有一定程度的抑菌作用（图3、表2）。

2.4突变体harpin蛋白的表达

从突变体中选取2株代表性菌株B3xm、B5xoo，用作后续研究。细胞破碎提取GST-harpin粗蛋白以及HAB-5、B3xm、B5xoo菌株总蛋白后，经SDS-PAGE电泳，在30～50 ku之间，约39、41 ku位置可见B3xm、B5xoo菌株总蛋白均存在明显条带，与GST-harpinXm、GST-harpinXoo相应位置的条带相同；而在HAB-5菌株总蛋白的泳道相同位置并未出现类似条带，表明融合蛋白GST-harpinXm、GST-harpinXoo在突变体B3xm、B5xoo菌体内得到表达。此外，与HAB-5菌株相比，B3xm、B5xoo在整个蛋白谱带上均发生了改变，表明突变体菌株在多肽和蛋白表达的种类、数量上也有很大改变（图4）。

2.5突变体粗蛋白过敏性反应检测及其特性

将GST-harpinXoo粗蛋白、GST-harpinXm粗蛋白、B3xm粗蛋白、B5xoo粗蛋白分别注射至烟草叶片中，18 h后均能在烟草叶片上产生过敏性反应，而HAB-5菌株粗蛋白不能产生过敏性反应。分别以100 ℃煮沸10 min、强酸、强碱处理突变体粗蛋白，仍能在18 h内激发HR；经蛋白酶K水解30 min、紫外光照射处理则完全丧失了激发HR的能力，表明突变体表达的harpin蛋白对酸碱不敏感，对热稳定、紫外线和蛋白酶K敏感，此结论与已报道的GST-harpinXoo、GST-harpinXm粗蛋白特性[8]相同（图5）。

2.6各菌株对番茄种子的促生效果

与清水对照相比，HAB-5、B3xm、B5xoo不同浓度菌悬液对胚芽、胚根的生长均有显著性差异。除10 亿CFU/mL外，随着浓度的降低，HAB-5菌悬液的胚芽生长分别比对照高10.85%、24.03%、26.36%、34.11%，胚根生长分别比对照高9.14%、26.29%、29.71%、36.00%，0.001 亿CFU/mL 为菌悬液的最适浓度，胚芽、胚根生长分别提高34.11%、36.00%；B3xm菌悬液的胚芽生长分别比对照高100.77%、59.70%、27.13%、44.19%、45.74%，胚根生长分别比对照高

69.14%、28.29%、21.71%、2400%、20.57%，10 亿CFU/mL为菌悬液的最适浓度，胚芽、胚根生长分别提高100.77%、69.14%；B5xoo菌悬液的胚芽生长分别比对照高68.21%、54.26%、69.77%、91.47%、46.51%，胚根生长分别比对照高36.86%、2571%、3857%、47.14%、38.86%，0.01亿CFU/mL为菌悬液的最适浓度，胚芽、胚根生长分别提高91.47%、4714%。可见，除10亿CFU/mL的HAB-5菌悬液外，不同浓度的菌悬液对番茄胚根、胚芽生长均有不同程度的促生作用；与HAB-5菌株相比，转化后的突变体菌株B3xm、B5xoo对胚芽和胚根的促生作用均有明显提高，且高浓度菌悬液对番茄种子的生长并无抑制作用（表3）。

3结论与讨论

目前，harpin蛋白基因表达宿主主要是大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌表达系统。大肠杆菌是经典的蛋白基因表达系统，能够高水平表达外源蛋白基因，但由于革兰氏阴性菌细胞壁复杂，具有双层膜结构，其分泌的水解酶常在信号肽的引导下跨越第1层膜后滞留在周质空间，因而很难将蛋白分泌到胞外；此外，大肠杆菌是一种潜在的病原菌，其生长过程中不断释放脂多糖等致热源物质，为产物的分离和纯化带来巨大困难[22]。酵母菌虽具有一定蛋白翻译后的加工能力，有利于真核蛋白的表达，但在表达外源基因时会出现产物蛋白不均一、降解、信号肽加工不完全、形成多聚体等问题，蛋白分泌效率低[23]。相对于前两者，芽孢杆菌表现出很大的优越性。王钰利用枯草芽孢杆菌表达harpin蛋白，生物活性检测、诱导植物抗病性分析结果表明，工程菌能够诱导烟草叶片产生过敏反应，并能提高番茄对早疫病菌的抗性[11]。乔俊卿等将harpin编码基因导入解淀粉芽孢杆菌FZB42菌株中，harpin蛋白可分泌到胞外并保持生物活性，表现出比出发菌株更好的促生和防病能力[12]。本研究将2种harpin编码基因导入短短芽孢杆菌HAB-5菌株中，反而降低了该菌株的抑菌能力，但能够诱导烟草叶片产生过敏反应，并提高出发菌株的促生能力。

关于芽孢杆菌生防菌株的构建，枯草芽孢杆菌的研究较为成熟，但由于其胞外蛋白酶活性很强，会大量降解外源蛋白，在构建工程生防菌株时具有较大局限性。苏云金芽孢杆菌虽然胞外蛋白酶活性不高，但野生菌株中含有大量内生质粒，而内生质粒对外源基因的导入和表达具有较大影响。本研究中短短芽孢杆菌HAB-5菌株的胞外蛋白酶活性仅为枯草芽孢杆菌的1.6%，且细胞壁较薄，内生质粒较少[24]，从而能有效防止外源蛋白的降解，促进外源基因的高效导入，使有促生防病效果的harpin蛋白与生防芽孢杆菌真正结合起来，研制出新型高效的生防制剂。以短短芽孢杆菌作为表达系统是研究热点，但未见其表达harpin的相关报道。本研究结果表明，将突变体菌体总蛋白B3xm、B5xoo注射至烟草叶片，均能在烟草叶片上产生明显的过敏性坏死斑；经SDS-PAGE电泳，分别在分子量大小为39、41 ku处可见明显条带，表明融合蛋白GST-harpinXm、GST-harpinXoo在突变体菌体内得到良好表达。此结论与编码harpin基因转入枯草芽孢杆菌[11]、解淀粉芽孢杆菌FZB42菌株的研究结论[12]相一致。

本研究通过化学方法成功将hpa1Xoo、hpaXm基因转入短短芽孢杆菌HAB-5菌株中，得到一系列转化子。虽转化效率很高，但得到的突变体菌落均发生了形态变化，且目前筛选出的突变体对致病菌的拮抗效果与原始菌株相比均不理想。已有研究表明，用质粒进行菌株标记时，由于质粒中报告基因、抗生素等基因的表达是在宿主菌体的复制、转录、翻译系统作用下进行的，消耗了宿主的物质和能量，对宿主造成代谢负担，可能影响宿主菌体的拮抗性能[25]。此外，在SDS-PAGE电泳过程中发现，突变体B3xm、B5xoo菌株在整个蛋白谱带上与HAB-5菌株有很大差异，菌株体内表达的多肽和蛋白质的数量、种类均发生了变化，从而使表达的抑菌活性物质发生改变。在突变体与病原菌C7-2菌株的对峙培养过程中，培养3 d后突变体对C7-2菌株表现出一定程度的抑菌作用，5 d后抑菌作用有所增强，7 d后抑菌作用逐渐减弱。已有研究表明，枯草芽孢杆菌代谢过程中产生的某些抗菌物质，可能作为营养物质被细菌本身和其他菌利用，导致抗菌物质减少、抑菌作用减弱[26-27]，此现象有待进一步验证。

在番茄种子促生试验中，与HAB-5菌株相比，突变体的促生作用明显提高，且转入hpaXm基因效果更佳，胚芽、胚根生长分别提高100.77%、69.14%，为今后微生物农药的开发提供依据。10亿CFU/mL HAB-5菌悬液对番茄种子的生长具有抑制作用，但随着浓度的降低，均能对番茄种子产生促生作用。宋永燕等在研究LM-3对水稻的促生作用时发现，低浓度拮抗菌无细胞滤液对植物均有促生作用，较高浓度的拮抗菌滤液则出现抑制作用[28]，这与本研究结论相似。在番茄种子促生试验中，未发现B3xm、B5xoo突变体菌株菌悬液抑制种子生长的现象，这可能与harpin蛋白在HAB-5菌株中的表达有关，有待开展后续相关研究，以期为生防菌的实际应用提供依据。

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