蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）再生体系的建立

谢菲　陈茹阳　赵惠恩

摘要：以蒙菊的叶片为试验材料，对蒙菊（Chrysanthemum mongolicum） 再生体系建立技术进行了初步探索。结果表明，蒙菊叶片愈伤诱导培养以MS+6-BA 2.0 mg/L +2，4-D 0.3 mg/L为最适培养基，出愈率87.50%；愈伤组织分化培养以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L为最适培养基，分化率为67.50%；生根培养以1/2MS+NAA 0.3 mg/L +蔗糖15 g/L为最适培养基，生根率为92.50%，平均根数5.33条，移栽成活率77.50%。

关键词：蒙菊；组织培养；再生体系；叶片；培养基

中图分类号： S682.1+10.4+3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0076-02

收稿日期：2014-12-18

基金项目：国家自然科学基金（编号：30970207）。

作者简介：谢菲（1990—），女，硕士研究生，主要从事花卉资源育种研究。E-mail： shelffy02@gmail.com。

通信作者：赵惠恩，博士，副教授，主要从事花卉资源育种研究。E-mail：zhaohuien@bjfu.edu.cn。蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）是菊科春黄菊族菊属多年生草本植物。蒙菊从我国内蒙古地区分布至北极地区，耐寒性显著，冬季能耐-40 ℃的低温。蒙菊生于贫瘠的石质山坡和亚高山地带，海拔1 500～2 500 m[1]，耐旱性较好，可以应用于屋顶绿化、荒坡绿化、岩石园绿化等方面。但蒙菊在我国分布区狭小，较难采集，引种后越夏困难，不易成活。通过建立蒙菊的再生体系可实现大规模扩繁，保存种质资源，提高引种成功率。蒙菊的再生体系研究至今未见报道，因此，系统深入研究其再生能力及获得再生植株，建立专门针对蒙菊的高效稳定的再生体系，可为菊花耐寒基因工程和转基因育种工作提供理论基础和试验依据，将有效推进高等植物抗性生物技术育种进程。本试验研究目的在于探究蒙菊在组织培养过程中各因素的作用及相互影响，建立出蒙菊的再生体系，为蒙菊的分子生物学研究、细胞学特性和基因工程中遗传受体系统的建立奠定理论基础，同时有利于实现蒙菊组培苗大规模的工厂化生产。

1材料与方法

1.1材料

本试验所用外植体为蒙菊组培无菌苗的叶片。

1.2方法

1.2.1愈伤组织的诱导从生长健壮的蒙菊组培苗上剪取0.5 cm2的叶片（图1-A），将叶片接入MS培养基中，植物生长调节剂选用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），2，4-D（0.1、0.2、0.3 mg/L），NAA浓度为0.01 mg/L [2]，采用2因素3水平完全随机试验设计[3]，每个处理重复3次。30 d后观察愈伤组织形态（图1-B），统计叶片的出愈率：出愈率=发生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%。

1.2.2愈伤组织分化培养将增殖后的愈伤组织接入分化培养基中，诱导其分化出芽点，形成幼小植株（图1-C）。试验采用2因素3水平的完全试验设计，植物生长调节剂选用6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L），NAA（0.05、0.10、0.20 mg/L）。每个处理接种20个0.5 cm3的愈伤组织，重复3次。在30 d后统计分化率，分化率=已分化的愈伤组织/接种愈伤组织总数×100%。

1.2.3壮苗由于长期生长在含有植物激素的培养条件下，继代培养所得到的部分芽苗形态细弱，营养不足，为了提高组培苗的生根率，需要将这些组培苗进行壮苗培养（图1-D）。将不足3 cm的芽苗移入MS培养基，含蔗糖35 g/L，培养30 d后转入生根培养。

1.2.4生根选择长约3 cm健壮的组培无根苗接入生根培养基中，含15 g/L蔗糖，6 g/L琼脂，每个处理接入20个组培苗，重复3次。试验采用2因素3水平完全试验设计，培养基分别设为MS、1/2MS、1/4MS，NAA分别为0.1、0.2、0.3 mg/L，分别在20 d后观察生根情况（图1-E），统计生根率和平均根数。生根率=生根的芽苗数/接种芽苗总数×100%；平均根数=总的根数/生根的苗数。

1.3数据分析

试验数据采用Excel和DPS（data processing system）软件进行数据统计、方差分析与多重比较，对百分率等数据进行方差分析时，先将数据进行反正弦转换。2结果与分析

2.1叶片愈伤组织的诱导试验

在蒙菊叶片的初代培养试验中，接种1周后，叶片开始卷曲，在切口边缘处产生团状愈伤组织，随着时间延长，愈伤组织的体积逐渐增大。从表1可以看出，A8处理MS+6-BA 2.00 mg/L +2，4-D 0.30 mg/L显著优于其他处理，出愈率87.50%，出愈时间较短，产生的愈伤组织为绿色，较致密，表面有小突起。A5处理的出愈率仅次于A8，但产生的愈伤组织颜色较浅，产愈量少。愈伤诱导率较低的是A1处理，出愈率42.50%，产生的愈伤组织呈透明状，含水量较高，质地较疏松，在接下来的试验中几乎不能分化。

2.2愈伤组织分化试验

对蒙菊愈伤分化过程进行观察，发现愈伤组织上的突起会逐渐分化成很多绿色的不定芽。由表2可见，B8处理 MS+6-BA 2.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L的分化效果最好，分化率为67.50%，愈伤表面有丛生芽形成。分化效果最差的处理为B6，分化率仅为15.00%，愈伤组织褐化严重。由此可见，褐化现象的防治对愈伤的增殖和分化有着积极的促进作用。

2.3生根培养

无根苗转入生根培养基中1周左右，多数处理中的蒙菊幼苗开始生根，根系呈辐射状，有白色、浅绿色、褐色几种不同类型。从表3可以看出，C6处理1/2MS+NAA 0.30 mg/L显著优于其他处理，生根率为92.50%，平均根数5.33条，根系健壮，白色，生长速度较快。生根情况较差的为C1处理，生根率为32.5%，根系细弱，呈浅绿色，部分根尖变褐，可能是由于培养基中大量元素浓度较高，对根系发育产生抑制作用。

在生根培养中观察到，当NAA浓度过高时，根部愈伤组织较多，形成的根短粗；当NAA浓度较高时，根部愈伤组织不多，形成的根辐射状，粗细适中，根毛较多；当NAA浓度较低时，愈伤组织较少，形成的根细长，数量较多，根毛较少。

2.4炼苗与移栽

首先选择较为健壮、高7 cm左右、根长1～3 cm的组培苗进行驯化。在出瓶之前，将培养容器置于较强光下，打开瓶盖增加通气，同时在培养基上加入1层无菌水。在开口3 d后进行组培苗的出瓶移栽。先将试管苗在40 ℃左右的温水中洗去黏附于组培苗根部的培养基，再放入1% KMnO4 溶液中浸泡5 min，冲洗干净，栽入经过高温灭菌的基质中，基质选用1/2珍珠岩+1/2草炭。

将移栽后的苗置于人工气候箱1周，调节湿度保持在70%以上、温度20 ℃左右，待生长稳定后放到阳光下让其生长[4]。每次移栽30株苗，重复3次试验，30 d后观察（图1-F），统计移栽成活率为87.50%。

在试验中发现形成新根的状态与炼苗的成活率有着密切的关系。当根健壮、根毛较多、整体呈白色、长度在1～3 cm、直径1 mm左右时炼苗成活率最高。而根细长、根数较多、根毛很少、根末端呈褐色、长度大于3 cm的植株炼苗成活较低。所以，选择根系最适的幼苗进行炼苗可以提高成活率。

3讨论与结论

研究表明，使用不同种类、不同浓度和不同比例关系的植物生长调节剂，可以调节培养物的生长发育进程、分化的方向和器官发生。当细胞分裂素/生长素的比值高时，利于芽的分化；而细胞分裂素/生长素的比值低时，有利于根的形成；当二者比值适中时，则愈伤组织处于旺盛的生长状态，没有器官分化[5]。在蒙菊的愈伤分化培养中采用 MS+NAA 0.20 mg/L+

6-BA 0.50 mg/L处理的培养基有少数愈伤组织出现先分化出根的现象，可能是由于6-BA/NAA的比值较低，促使根器官先发生。

本次试验采用的植物生长调节剂有6-BA、NAA、2，4-D 3种。试验结果表明，在初代培养中，适当添加6-BA、NAA、2，4-D可以有效促进芽的萌动和愈伤组织的诱导。其中2，4-D对愈伤组织的诱导有着明显的促进作用，但用量过高会产生毒害作用，使形态畸变，诱导率降低。在继代培养中6-BA对不定芽的增殖有较好的促进效果，但在试验观察中发现高浓度的6-BA培养基中长期培养会出现较多玻璃化现象。在生根培养中，NAA的运用有利于植株根系萌动，当NAA浓度较高时，形成的根粗壮，根毛较多；当NAA浓度较低时，形成的根细长、数量较多、根毛较少。

在本试验中，出现了叶片诱导时出愈率较高，但愈伤组织增殖系数不高、分化较少的现象，即使愈伤组织能分化出少量芽，也会因培养时间过长无营养而生长缓慢甚至死掉。分析原因，一方面可能是初代培养使用的激素浓度不当，虽然出愈率较高，但所诱导的愈伤组织大多数是比较致密的愈伤组织，很少有粗颗粒状突起，难以增殖分化成芽；另一方面可能是由于植物本身的生理状态和遗传特性等因素造成的愈伤组织生长情况不佳[6]；此外，光照、温度等培养条件不适宜都可能是造成愈伤组织难分化成芽及分化的芽不易成活的因素。具体的愈伤组织分化成苗较难的原因还有待于进一步深入研究。

参考文献：

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[3]续九如，黄智慧. 林业试验设计[M]. 北京：中国林业出版社，1995：8-9.

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[5]李永文，刘新波，黄海帆，等. 植物组织培养技术[M]. 北京：北京大学出版社，2007：45-47.

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