高脚鸡、矮脚鸡和百宜黑鸡GH基因多态性及生物信息学分析

杨红++张勇++田启培等

摘要：以高脚鸡、矮脚鸡和百宜黑鸡为研究对象，构建品种DNA池，PCR扩增生长激素（GH）基因所有外显子和部分内含子序列，采用直接测序法对3个鸡种的GH基因进行多态性检测，利用生物信息学软件预测不同多态性位点对GH基因mRNA二级结构的影响，旨在通过对贵州胫长差异较大的高脚鸡、矮脚鸡和百宜黑鸡GH基因的多态性及其生物信息学进行分析，研究GH基因对不同鸡种胫骨发育的影响。结果表明：在高脚鸡、矮脚鸡和百宜黑鸡3个鸡种GH基因中共检测到8个SNPs位点，其中A1133G、G1166A位于第2内含子区，C2027G、C2030T位于第4外显子区，G2152A位于第4内含子区，G3347A位于第5外显子区，T3416C和C3436T位于3′非编码区。生物信息学分析显示位于外显子区的3个SNPs均为同义突变，对GH基因的mRNA二级结构有一定影响。

关键词：DNA池；GH基因；胫骨长度；SNPs；高脚鸡；矮脚鸡；百宜黑鸡

中图分类号：S831.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）11-0038-04

收稿日期：2014-11-03

基金项目：贵州省科技计划（编号：黔合科NZ字[2012]3007号）；贵州省农业动植物育种专项（编号：黔农育专字[2012]10号）；浙江大学基本科研业务费专项资金（编号：2012XZZX003-1）。

作者简介：杨红（1990—），女，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与种质资源创新。Email：15085933126@139.com。

通信作者：王芳芳，女，高级畜牧师，主要从事家禽遗传育种及饲养管理工作。E-mail：1587676665@qq.com。贵州省地形复杂、地貌特殊，具有丰富的地方鸡种资源，其中包括竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、高脚鸡、矮脚鸡、百宜黑鸡等。高脚鸡、矮脚鸡、百宜黑鸡均为贵州省特有的地方鸡种，在体型外貌尤其是胫骨长度上存在较大差异。高脚鸡是贵州省特有的地方品种，1982年录入《贵州省畜禽品种志》，2006年录入《中国畜禽资源名录》，其胫骨比其他品种鸡长3～4 cm，公鸡平均胫长13.62 cm、母鸡平均胫长 10.92 cm[1]。矮脚鸡分布于贵州省黔西南州兴义市，其胫长较普通鸡短，公鸡平均胫长6.5 cm、母鸡平均胫长5.9 cm[2]，1993年录入《贵州省畜禽品种志》。百宜黑鸡为贵州优质地方鸡种，主产地为贵阳市乌当区百宜乡[3]，其胫骨长度介于高脚鸡和矮脚之间。

鸡生长激素（chiken growth hormone，cGH）是由垂体前叶合成和分泌的一种多肽类激素，由191个氨基酸组成。研究报道称该激素在鸡生长发育、骨骼生长、脂肪沉积、饲料转化及产蛋等方面具有调节作用[4]。该基因位于1号染色体，全长近4 kb，由5个外显子和4个内含子组成，且内含子远大于外显子[5-6]。国内外学者相继发现GH基因的多态位点对鸡各类生长性状有特定影响[7-10]。对于贵州省境内部分鸡种的GH基因已有相关研究，如朱丽莉等对兴义矮脚鸡GH基因的多态性研究中发现该鸡种在第一内含子区域存在较多变异[11]。黄波等在对贵州小香鸡GH基因研究中，对GH基因2～3外显子区域SNP位点进行了检测并开展了相关性分析[12]。本试验选择胫骨长度差异较大的高脚鸡、矮脚鸡、百宜黑鸡作为对象，研究GH基因的多态性，并进行生物信息学分析，旨在检测GH基因在不同胫长性状鸡种中的差异，以期探究GH基因多态性与胫骨生长发育的关系，为进一步研究影响胫骨发育机制的功能基因奠定工作基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物高脚鸡92个血样采自贵州省安顺市普定县，矮脚鸡99个血样采自贵州省黔西南州兴义市兴牧畜禽水产科技服务中心矮脚鸡养殖场，百宜黑鸡69个血样采自其中心产区贵州省贵阳市百宜乡。每羽鸡翅下静脉采血2～3 mL于真空采血管中，肝素钠抗凝，-20 ℃保存。

1.1.2主要试剂血液基因组DNA提取试剂盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、DL2000 DNA Marker 等试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。实验室自备试剂为去离子水、无水乙醇、TAE缓冲液等。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取、检测及构建DNA池运用上海生工生物工程技术服务有限公司血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，用含核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，凝胶成像系统照相保存，并用紫外分光光度计测量DNA样品浓度，每个样品测量3次，取平均值。用ddH2O将所有DNA样品调至100 ng/μL，各取10 μL构建品种DNA池[13]，-20 ℃保存备用。

1.2.2引物设计与PCR扩增参照GenBank（登录号为 NC_006114.3）提供的鸡GH基因序列，运用 Primer Premier 6.0 和 Oligo 6.0 设计引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列及扩增条件如表1。

2结果与分析

2.1DNA提取结果

将提取的DNA用含核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。由图1可见，DNA条带集中，整齐明亮无拖尾，可用于下一步试验。

2.2PCR产物检测结果

PCR产物用含核酸染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2：所检测片段与预期片段大小相符，条带清晰、整齐无拖尾，PCR产物特异性较好，可用于进一步测序分析。

2.3序列分析

在所扩增的序列中共发现6个SNPs 位点：第2内含子A1133G、G1166A，第4外显子C2027G、C2030T，第4内含子G2152A，第5外显子G3347A，3′非编码区T3416C、 C3436T（图3）。

2.4等位基因频率估算

从表2可见，3个鸡种在A1133G、G1166A、C2027G、G2152A、C3436T这5个SNPs位点上基因频率存在较大差异。

2.5GH基因所有外显子RNA二级结构预测结果

采用在线软件 RNAfold web server分别对在GH基因外显子中的3个 SNPs 位点 mRNA进行预测，结果见图4。

3讨论

鸡胫骨为全身长骨之一，其生长过程受到多种激素及细胞因子调控，且存在不同的信号通路。GH基因是调控禽类整个机体的重要激素，具有加快肌肉和骨骼生长、促进生长发育及提高饲料报酬的作用[15-17]，也有研究报道称GH基因可促进鸡长骨和软骨的发育[18]。朱丽莉等对贵州个体较小的矮脚鸡、小香鸡的GH基因进行了多态性分析，发现较多变异位点，通过关联性分析得到该基因对体斜长、胫长、胫围等生长性状有一定的影响[11-12]。

本研究对胫长差异较大的高脚鸡、矮脚鸡和百宜黑鸡的GH基因所有外显子和部分内含子进行了单核苷酸多态性检测，发现了8个可能与胫长性状相关的SNPs位点，分别为A1133G、G1166A、C2027G、C2030T、G2152A、G3347A、T3416C、C3436T。其中C2027G、C2030T等2个SNPs位点位于第4外显子区，G3347A位于第5外显子区，3个位于外显子区域的SNP位点均为同义突变。

各SNPs位点分析发现，在第2内含子区A1133G处，只有高脚鸡发生了突变，矮脚鸡与百宜黑鸡均未发生突变；第4内含子G2152A处，高脚鸡的优势碱基为G，矮脚鸡与百宜黑鸡的优势碱基则为A；3′非编码区C3436T处，高脚鸡未发现SNPs位点，而矮脚鸡、百宜黑鸡却存在突变。这表明高脚鸡在A1133G、G2152A、C3436T这3个SNPs位点上与其他2个鸡种存在较大差异，推测这2个SNPs位点可能对高脚鸡胫骨长度有较大影响。在G1166A、C2027G位点处，矮脚鸡发生突变的基因频率与高脚鸡和百宜黑鸡差异较大，推测这2个SNPs位点可能与矮脚鸡胫骨较短存在相关性。同时，在C2027G位点处，这3个贵州地方鸡种的优势碱基均为G，而GenBank（登录号为NC_006114.3）中所报道的则为C，这可能是贵州地方鸡种的一个共同特征，同时也是贵州地方鸡种与其他鸡种之间所存在的普遍差异。

真核生物的基因一般由若干个外显子和内含子组成，为断裂基因，外显子的功能是构成编码区编码功能蛋白，编码区内核苷酸的变异可能导致基因mRNA二级结构改变，进而导致蛋白质结构改变而影响其生物功能[15]。本研究中所检测出的3个SNPs位点均未引起所编码氨基酸改变，为同义突变。运用生物信息学软件进行进一步分析发现，所检测到的3个SNPs位点均导致了GH基因mRNA二级结构改变，使其最小自由能发生变化，从而影响mRNA二级结构稳定性。当C2027G发生C→G突变后，GH基因mRNA二级结构最小自由能增加了167.894 kJ/mol，其稳定性减弱；当C2030T发生C→T突变后，GH基因mRNA二级结构最小自由能减少了2.51 kJ/mol，其结构稳定性增加；当G3347A发生G→T突变后，GH基因mRNA二级结构最小自由能增加了7.093 kJ/mol，其结构稳定性减弱。GH基因突变与鸡胫骨长度的关系及其引起的mRNA二级结构变化所发生的生物学意义将在后续试验中进一步加以研究。

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