Slc25a3基因在低硒大鼠心肌细胞内的表达①

初而复,屈玮婷,李　欣,张明亮,卢均坤

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.齐齐哈尔建华医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)



Slc25a3基因在低硒大鼠心肌细胞内的表达①

初而复1,屈玮婷2,李欣1,张明亮1,卢均坤1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.齐齐哈尔建华医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

摘要:目的:探讨低硒状态下SD大鼠心肌细胞内Slc25a3基因的表达情况。方法:将24只正常成年雄性SD大鼠随机等分为低硒组和正常组。两组大鼠分别给予低硒饮食及正常饮食。饲养4周后，进行动物模型鉴定实验。采用荧光法检测两组大鼠主要脏器的硒含量、采用谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒检测肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx-1)的活性、采用Real-time PCR方法检测GPx-1的mRNA水平的相对表达、采用丙二醛(MDA)测定试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)测试盒检测两组动物模型主要脏器中MDA含量和SOD活性；8周后，脊髓离断处死全部大鼠，取心脏组织进行下一步实验。结果:低硒组大鼠体内主要脏器硒含量均明显低于对照组，氧化应激水平明显高于对照组，心肌细胞内Slc25a3基因相对表达量明显高于对照组。结论:硒元素缺乏可以导致大鼠心肌细胞内Slc25a3基因相对表达量明显升高。

关键词：低硒；大鼠；MPTP；氧化应激；Slc25a3基因

线粒体是细胞物质与能量代谢的重要场所，它能通过电子传递链的氧化磷酸化反应为有机体提供90%的ATP能源，维持机体的各项生理机能[1]。线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)大量开放是导致线粒体功能障碍的关键[2]。PiC是位于线粒体内膜上的一种重要的功能蛋白，其功能主要是使重要的代谢底物：无机磷酸(Pi)从细胞质转移到线粒体基质[3]。研究表明，PiC可以在MPTP开放中发挥重要作用[4]。PiC由多种编码基因共同调控，其中Slc25a3基因是编码PiC基因的重要组成部分，研究发现PiC的表达量与Slc25a3的表达情况密切相关[5]。

微量元素硒(selenium, Se)是哺乳动物体内的一种必需微量元素，在机体内许多生物学过程中都发挥着重要功能。研究证实，硒元素缺乏可以导致心血管、内分泌、生殖等多个系统功能发生异常，与很多疾病的发生及发展有密切的关系[6]。但硒元素缺乏是否可以导致心肌细胞内能量代谢发生异常改变，尚未见报道。本研究通过构建低硒动物模型，对低硒大鼠心肌细胞内Pic基因的表达情况进行研究，从而揭示了低硒状态下，大鼠心肌细胞能量代谢变化的可能途径。

1　材料与方法

1.1实验动物及饲料

正常成年雄性SD大鼠24 只，体重180~220g，均购买自哈尔滨医科大学实验动物中心；正常饲料，购买自佳木斯大学实验动物中心；自制低硒饲料，以低硒酵母为主要原料，同时加入蔗糖、各种维生素以及除硒元素以外的各种微量元素配制而成的粉末状饲料。

1.2实验试剂

谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(南京碧云天，中国)，超氧化物歧化酶检测试剂盒(南京碧云天，中国)，丙二醛检测试剂盒(南京碧云天，中国)，Trizol(Invitrogen，美国)，DEPC(Sigma，美国)，ABI SybrGreen PCR Master Mix(ABI，美国)，引物(上海生工公司，中国)，抗体(Santa, 美国)。

1.3动物模型建立

两组实验动物均在清洁级动物室中进行饲养。将24 只正常成年雄性SD大鼠随机等分为低硒组和正常组。低硒组给予自制低硒饲料及去离子水喂养，正常组给予正常饲料及高温灭菌后的自来水喂养。饲养4 周后，随机选取两组各6 只大鼠确定低硒动物模型建立是否成功。脊髓离断处死大鼠，分别取心脏、肝脏、肾脏组织以及采集下腔静脉中静脉血液，采用荧光法检测两组大鼠主要脏器的硒含量、采用谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)试剂盒检测肝脏中GPx-1的活性[7]、采用Real-time PCR检测GPx-1的mRNA表达情况、采用丙二醛(MDA)测定试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)测试盒检测两组大鼠主要脏器的MDA含量[8]和SOD活性[9]；8周后，剩余全部大鼠采用脊髓离断的方法处死，取心脏组织进行下一步实验。本实验严格遵循《实验动物保护条例》。

1.4低硒动物模型鉴定

取适量组织样本在冰浴下用匀浆器匀浆，用生理盐水制成10%的组织匀浆，4℃ 3000rpm离心10min，取上清液检测。严格按照试剂盒说明，检测两组大鼠主要脏器内硒含量，两组大鼠肝脏组织内GPx-1活性及其mRNA表达情况，同时检测两组大鼠各脏器SOD活力及MDA含量，所有操作步骤均严格按照说明书进行。

1.5Real-time PCR检测PiC基因的表达

心脏组织RNA提取采用Trizol试剂提取方法。采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒于PCR反应扩增仪(ABI，美国)上将提取的总RNA逆转录为cDNA。Real-time PCR 采用ABI SybrGreen PCR试剂盒说明书在20 μL反应体系中进行PCR扩增。采用Livak法即2-(ΔΔCt)法对PCR的数据进行分析，上述实验重复三次。本实验中的引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行数据统计，各组间的数据比较采用t检验分析，以P<0.05为有显著性差异。

2　结果

2.1两组大鼠肝脏、心脏、肾脏及静脉血液硒含量检测

结果显示，低硒组大鼠的肝脏、心脏、肾脏以及静脉血液的硒含量均明显低于正常组(*P<0.01)。我们发现，低硒组大鼠的肝脏硒含量为正对照组的36.13 %(A)，心脏硒含量为正常组的56.42 %(B)，肾脏硒含量为对照组的34.88 %(C)，静脉血液硒含量为对照组的37.05 %(D),见图1。

图1　两组大鼠肝脏(A)、心脏(B)、肾脏(C)及静脉血液(D)硒含量检测

2.2两组大鼠肝脏GPx-1活性及其mRNA表达

结果显示，低硒组大鼠肝脏内GPx-1的活性及其mRNA表达水平均明显低于对照组(*P<0.01)。通过对低硒组大鼠肝脏中含硒蛋白GPx活性的检测说明低硒组大鼠体内硒含量的缺乏，导致了含硒蛋白活性的减低，而GPx-1基因mRNA表达下调也进一步证明了低硒动物模型建立成功，见图2。

图2　母体SD大鼠肝脏GPx-1活性

2.3两组大鼠MDA含量与SOD活性的测定

结果显示，低硒组大鼠主要脏器MDA含量明显高于对照组(A)，而SOD活性低于对照组(B)(*P<0.01)。结果表明，低硒组大鼠处于高氧化应激状态。研究证实哺乳动物体内硒元素缺乏可以使机体处于高氧化应激状态，因此本结果间接证明低硒动物模型建立成功[14]，见图3。

图3　两组大鼠各脏器MDA含量(A)及SOD活力(B)检测

2.4Real-time PCR技术检测Slc25a3基因的表达

结果显示，低硒组大鼠心肌细胞内Slc25a3基因相对表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义(*P<0.05)，见图4。

图4　两组大鼠心肌细胞内Slc25a3基因的表达

3　讨论

微量元素硒是机体的一种必需微量元素，在许多生物学过程中发挥着重要功能。硒的生物学作用主要是通过硒蛋白来体现的。机体要不断摄入外源硒来维持体内硒平衡。因此当食物或饲料中硒含量降低，生物就会处于全身硒水平较低的状态。MPTP大量开放是导致线粒体功能障碍的关键，而PiC是构成MPTP的关键性线粒体内膜成分。研究证实肌间纤维线粒体Slc25a3合成显著减少，ATP合成也显著减少，随着线粒体蛋白组学异常，心脏功能失调[10]。本研究通过建立低硒SD大鼠模型，对低硒大鼠心肌细胞内Pic基因的表达情况进行研究，从而揭示了低硒状态下，大鼠心肌细胞能量代谢变化的可能途径。研究表明，PiC是构成MPTP的关键性成分，心肌细胞内氧化应激水平的改变是影响PiC基因表达的一个重要因素，因此PiC的显著升高可以导致MPTP的大量开放，从而引起线粒体功能出现异常[11]。本实验通过对低硒和正常两种状态下，大鼠心肌细胞内PiC基因的表达情况进行对比，旨在揭示硒元素在哺乳动物心肌细胞内可以发挥重要作用，缺乏硒元素可导致心肌细胞能量代谢发生明显改变，为下一步的人体研究提供了基础研究的实验依据。

参考文献：

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[3]卢均坤，苗秋实，吕维娟，等.姜黄素对阿霉素所致大鼠急性心肌损伤的保护作用[J]. 黑龙江医药科学，2013，36(5):5-7

[4]Varanyuwatana P, Halestrap AP. The roles of phosphate and the phosphate carrier in the mitochondrial permeability transition pore [J]. Mitochondrion，2012，12(1):120-125

[5]Bhoj EJ, Li M, Ahrens-Nicklas R, et al. Pathologic Variants of the Mitochondrial Phosphate Carrier SLC25A3: Two New Patients and Expansion of the Cardiomyopathy/Skeletal Myopathy Phenotype With and Without Lactic Acidosis [J]. JIMD Rep，2015：15

[6]Kalishwaralal K, Jeyabharathi S, Sundar K,et al. Sodium selenite/selenium nanoparticles (SeNPs) protect cardiomyoblasts and zebrafish embryos against ethanol induced oxidative stress[J]. J Trace Elem Med Biol，2015，32:135-44

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[8]Zhang ZW, Wang QH, Zhang JL，et al. Effects of Oxidative Stress on Immunosuppression Induced by Selenium Deficiency in Chickens [J]. Biol Trace Elem Res, 2012，149(3):352-361

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[11]徐辉, 魏晓东, 欧芹，等.肉苁蓉不同成分抗衰老作用的研究[J]. 黑龙江医药科学, 2011, 34(1): 1-2

中图分类号：R-332;Q505

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-0033-02

基金项目：①1.黑龙江省自然科学基金项目，编号：H201365；2.佳木斯大学重点项目，编号：Sz2013-004；3.佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LZZ2015_017。

作者简介：初而复(1985～)男，山东烟台人，在读硕士研究生。

通讯作者：卢均坤(1972～)男，山东日照人，硕士，副教授，副主任医师，硕士研究生导师。E-mail：ljkuuu@163.com。

(收稿日期：2015-09-16)