高效液相色谱-蒸发光散射法测定黄芪中单糖和双糖的含量

李　芳，胡容峰，黄丽丹，王　斌

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥　230038； 2.省部共建新安医学教育部重点实验室，

安徽 合肥　230038；3.安徽省“115”新安医药研究与开发创新团队，安徽 合肥　230038；4.安徽省

中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥　230012；5.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥　230051)



高效液相色谱-蒸发光散射法测定黄芪中单糖和双糖的含量

李芳1，2，胡容峰2，3，4，黄丽丹5，王斌2

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥230038； 2.省部共建新安医学教育部重点实验室，

安徽 合肥230038；3.安徽省“115”新安医药研究与开发创新团队，安徽 合肥230038；4.安徽省

中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥230012；5.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥230051)

[摘要]目的采用高效液相色谱-蒸发光散射法建立黄芪中单糖和双糖含量的测定方法。方法色谱柱为Waters X BridgeTM氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(70∶30)，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。蒸发光散射检测器参数：雾化器温度为50 ℃，漂移管温度为90 ℃，气体流量为1.60 L/min，增益值为1.0。结果果糖、蔗糖和麦芽糖分别在0.10~0.90 μg(r=0.999 9)、1.00~9.00 μg(r=0.999 6)、0.25~2.25 μg(r=0.999 4)范围内其对数值与峰面积的对数值呈良好的线性关系；平均回收率分别为97.97%(RSD=1.56%)、97.82%(RSD=1.53%)、97.36%(RSD=1.59%)。结论所建立的高效液相色谱-蒸发光散射法简单、准确、重复性好，可用于黄芪中单糖和双糖的含量测定。

[关键词]黄芪；高效液相色谱-蒸发光散射法；果糖；蔗糖；麦芽糖

中药复方脑络欣通是著名新安医家王乐匋先生针对缺血性中风而创立的临床验方，黄芪是复方脑络欣通中君药[1]。黄芪是豆科草本植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao或荚膜黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效[2],临床上应用于治疗病毒性心肌炎、糖尿病、炎症和肿瘤[3-6]。

黄芪药材中含有丰富的糖类成分，测定糖类成分的含量常用的方法是比色法，此方法稳定性和操作精密度都较差，且只能测定总糖含量，不能分析糖的种类，高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)可改善以上不足[7]。目前针对黄芪中糖类成分的研究主要集中在多糖方面，而对于单糖和双糖的研究报道却很少。本实验中笔者采用HPLC和蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector，ELSD)建立了黄芪中单糖和双糖含量的测定方法。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1260高效液相色谱仪和Agilent380-ELSD检测器：美国安捷伦公司；Waters X BridgeTM氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)：美国沃特世公司；ML204型电子天平：瑞典METTLER TOLEDO公司；HH-S2系列恒温水浴锅：江苏金坛市环宇科学仪器厂；WB-2000旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；Heraeus Multifuge X1R离心机：赛默飞世尔科技公司；KQ-2200 型超声波清洗器：江苏省昆山市超声仪器有限公司。

1.2试药果糖对照品(批号 100231-200904，供含量测定用)、蔗糖对照品(批号 111507-201303，供含量测定用)和麦芽糖对照品(批号 100287-201102，供含量测定用)：均购于中国食品药品检定研究院；黄芪(产地为内蒙古，批号 12091301)：购于合肥乐家老铺中药饮片有限公司；乙腈：色谱纯，瑞典；水为纯化水；其他试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱为Waters X BridgeTM氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(70∶30)，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。ELSD参数：雾化器温度为50 ℃，漂移管温度为90 ℃，蒸发器气流为1.60 L/min，增益值为1.0。此条件下HPLC色谱图见图1。

2.2对照品溶液的配制精密称取适量果糖、蔗糖、麦芽糖对照品，分别置于容量瓶中，加入纯化水配成浓度分别为0.10 mg/mL的果糖溶液、1.00 mg/mL的蔗糖溶液、0.25 mg/mL的麦芽糖溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，作为对照品溶液。

图1果糖对照品(A)、蔗糖对照品(B)、麦芽糖对照品(C)和黄芪样品(D)的高效液相色谱图

2.3供试品溶液的制备取黄芪药材2.0 g，置于圆底烧瓶中，加50 mL水回流提取2次，第1次2 h，第2次1 h，过滤后，合并滤液，将以上滤液浓缩至50 mL后，向其中加入Sevage试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)10 mL，剧烈振摇混匀后，在3 000 r/min下离心10 min，收集上层水相溶液同法反复除蛋白4次后，将上层溶液转移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀后，经0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

2.4线性范围考察分别进样果糖、蔗糖、麦芽糖对照品溶液1、3、5、7、9 μL，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积的常用对数值(y)为纵坐标，以果糖、蔗糖、麦芽糖进样量的常用对数值(x)为横坐标，绘制标准曲线，得果糖回归方程为y=0.994 8x+2.018 6(r=0.999 9)，蔗糖回归方程为y=0.993 2x+2.552 1(r=0.999 6)，麦芽糖回归方程为y=0.997 2x+2.236 2(r=0.999 4)。结果表明果糖、蔗糖、麦芽糖进样量分别在0.10~0.90 μg、1.00~9.00 μg、0.25~2.25 μg范围内其对数值与峰面积的对数值呈良好的线性关系。

2.5精密度试验分别取同一对照品溶液重复进样5次，进样量为5 μL，记录峰面积，计算得果糖、蔗糖、麦芽糖峰面积的RSD分别为1.70%、1.32%、1.51%。

2.6重复性试验取同一批样品5份，按照“2.3”项下方法制备5份供试品溶液，分别进样5 μL，记录峰面积，计算得果糖、蔗糖、麦芽糖含量的RSD分别为1.13%、1.37%、1.29%。结果表明，此方法重复性良好。

2.7稳定性试验取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16、24 h各进样1次，进样量为5 μL，记录峰面积，计算得果糖、蔗糖、麦芽糖峰面积的RSD分别为1.63%、1.38%、1.44%。结果表明，样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验分别称取已知果糖、蔗糖、麦芽糖含量的样品6份，每份0.20 g，分别加入果糖(5 mg/mL)、蔗糖(20 mg/mL)、麦芽糖(5 mg/mL)对照品溶液1.13、2.85、1.16 mL，按照“2.3”项下方法制备加样回收率供试液，分别进样5 μL，记录峰面积，计算回收率。得果糖、蔗糖、麦芽糖的平均回收率分别为97.97%(RSD=1.56%)、97.82%(RSD=1.53%)、97.36%(RSD=1.59%)。

2.9样品含量测定将已制备的供试品溶液注入高效液相色谱仪中，进样量为5 μL，按照上述色谱条件测定黄芪样品中果糖、蔗糖、麦芽糖，计算得黄芪样品中果糖含量是2.84%，蔗糖含量是4.25%，麦芽糖含量是2.92%。

3讨论

本课题组前期实验已对样品溶液的制备和色谱条件进行了优选。对不同提取溶剂制备的样品溶液进行反复考察，最终选择水为提取溶剂。水提取后用Sevage试剂除去其中蛋白，防止产生干扰，此方法所制备的样品溶液中杂质较少。流动相为乙腈-水时，样品中各色谱峰分离较好。对雾化器和漂移管的温度进行考察，优选温度分别为50 ℃和90 ℃。对色谱柱的类型进行考察，分别使用Waters公司的氨基柱、Global公司的C18色谱柱和Welch公司的C8色谱柱进行分析，结果显示，Waters公司的氨基柱分离效果较好。

由于糖类物质在紫外区没有响应，若用紫外检测器，需要对糖类成分进行衍生化，衍生化反应可能会衍生不彻底，增加含量测定的误差。ELSD可测定无紫外吸收的物质，无需衍生化反应，可直接测定糖类成分的含量。

本课题组前期实验以果糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖对黄芪样品进行定性分析，结果显示，样品中含有果糖、葡萄糖和蔗糖。故选择果糖、葡萄糖和蔗糖作为对照品。

本实验中笔者采用HPLC-ELSD所建立的黄芪中果糖、蔗糖和麦芽糖含量测定方法，具有操作简便、重复性好的优点，可为研究黄芪糖类成分提供一种新的方法。

参考文献：

[1]王键，谭辉，胡建鹏，等.脑络欣通对大脑中动脉闭塞缺血再灌注损伤模型大鼠空间认知功能和局部脑血流量的影响[J].中医杂志，2013，54(8)：687-690.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：283-284.

[3]丘银冰，李小林，陈秀连，等.黄芪治疗病毒性心肌炎51例体会[J].中国医药导报，2007，4(3)：80.

[4]Sang Z，Zhou L，Fan X，et al. Radix Astragali(Huangqi)as a treatment for defective hypoglycemia counterregulation in diabetes[J].Am J Chin Med，2010，38(6)：1027-1038.

[5]Lee DY，Noh HJ，Choi J. Anti-inflammatory cycloartane-type saponins ofAstragalusmembranaceus[J].Molecules，2013，18(4)：3725-32.

[6]Yang B，Xiao B，Sun T. Antitumor and immunomodulatory activity ofAstragalusmembranaceuspolysaccharides in H22 tumor-bearing mice[J]. Int J Biol Macromol，2013， 62：287-290.

[7]张国伟，李彩霞，王艳峰，等.高效液相法与硫酸-蒽酮法测定猪苓多糖含量比较[J].天然产物研究与开发，2011，23(12)：1099-1102.

Determination of Monosaccharide and Disaccharide inAstragalusmembranaceusby High-performance Liquid Chromatography with Evaporative Light-scattering Detector

LIFang1,2,HURong-feng2,3,4,HUANGLi-dan5,WANGBin2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.KeyLaboratoryofXin’anMedicineJointlySupportedbyMinistryofEducationandAnhuiProvince,AnhuiHefei230038,China; 3.Anhui“115”Xin’anTraditionalChineseMedicalResearch&DevelopmentInnovationTeam,AnhuiHefei230038,China; 4.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 5.AnhuiInstituteforFoodandDrugControl,AnhuiHefei230051,China)

[Abstract]Objective To establish the method for determining the content of monosaccharide and disaccharide in Astragalus membranaceus by high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector (HPLC-ELSD). MethodsHPLC parameters were as follows: Waters X BridgeTMamino column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) as the chromatographic column; acetonitrile-water (70∶30) as the mobile phase; flow rate 1.0 mL/min; column temperature 30 ℃. ELSD parameters were as follows: nebulizer temperature 50 ℃; drift tube temperature 90 ℃;gas flow rate 1.60 L/min; gain 1.0. ResultsFructose,sucrose,and maltose showed a good linear relationship between the logarithmic values of content and peak area within 0.10-0.90 μg (r=0.999 9),1.00-9.00 μg (r=0.999 6),and 0.25-2.25 μg (r=0.999 4),and the average recovery rates were 97.97% (relative standard deviation (RSD)=1.56%), 97.82% (RSD=1.53%), and 97.36% (RSD=1.59%), respectively. ConclusionThe established HPLC-ELSD method is simple, accurate, and repeatable, and can be used for determining the content of monosaccharide and disaccharide in Astragalus membranaceus.

[Key words]Astragalus membranaceus; high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector; fructose; sucrose; maltose

收稿日期：(2014-04-11；编辑：曹健)

通信作者：胡容峰，hurongfeng@163.com

作者简介：李芳(1988-)，女，硕士研究生

[中图分类号]R927.2

[文献标志码]A[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.024

基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAI26B03)；国家自然科学基金项目(81274100)；安徽省学术和技术带头人及后备人选学术科研活动经费资助项目(皖人社秘2011-381号-26)