金莲花总黄酮对人甲状腺乳头癌K1细胞三叶因子3表达变化的影响

房涛　张静　吴靖芳　张文静　张晨磊　张芸芸　裴达

金莲花总黄酮对人甲状腺乳头癌K1细胞三叶因子3表达变化的影响

房涛张静吴靖芳张文静张晨磊张芸芸裴达

【摘要】目的探讨金莲花总黄酮对人甲状腺乳头癌K1细胞增殖抑制作用及三叶因子3(TFF3)表达变化。方法不同浓度金莲花总黄酮作用于体外培养K1细胞24、48、72 h，MTT检测细胞生长抑制率，Western blotting和Real-time PCR检测不同浓度总黄酮对K1细胞TFF3蛋白及mRNA表达的影响。结果MTT实验结果表明，同一时间总黄酮对K1细胞生长增殖抑制率随着药物浓度的增高而升高(P＜0.05)，同一浓度总黄酮对K1细胞抑制率随时间延长而升高(P＜0.05)。Western blot及QPCR结果显示随着金莲花总黄酮浓度的升高K1细胞TFF3蛋白及mRNA水平下降(P＜0.05)。结论金莲花总黄酮对人甲状腺乳头癌细胞具有抑制作用，并能抑制TFF3的表达。

【关键词】金莲花总黄酮;乳头状甲状腺癌;三叶因子3

【中图分类号】R 736.1

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)16－2405－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.001

【ABSTRACT】Objective To investigate the inhibition effect of Trollius flavonoids on the proliferation of Trefoil factor 3(TFF3)in human papillary thyroid cancer K1 cells in vitro，and to explore its effect on the expression of TFF3 in K1 cells.Methods The K1 cells cultured in vitro were treated by different concentrations of Trollius flavonoids for 24h，48h，72h，respectively，then the inhibition rate on K1 cells growth was dectected bymTT.The changes of expression of TFF3 protein/mRNA were detected by Western blotting and Real-time PCR，respectively.ResultsmTT detection showed that Trollius flavonoids had inhibition effects on proliferation and growth of K1 cells in a dose and time dependentmanner(P＜0.05).The examination results by Western blotting and Real-time PCR showed that the expression levels of TFF3 protein andmRNA of K1 cells were decreased with the increase of flavonoids concentration(P＜0.05).Conclusion Trollius flavonoids have the inhibition effect on human throid papillary cancer cells and can inhibit the expression of TFF3.

收稿日期:(2015－04－11)

项目来源:河北省中医药管理局课题(编号:2013079)

作者单位: 075000河北省张家口市第一医院外科(房涛);河北北方学院组织胚胎学教研室(张静、吴靖芳、张文静)，2012级临床本科(张晨磊、张芸芸、裴达)

通讯作者:张静，075000河北省张家口市，河北北方学院组织胚胎学教研室;

E-mail: zjokokok@163.com

Effects of Trollius flavonoids on the expression of Trefoil factor 3 in human papillary thyroid cancer K1 cells in vitro

FANG Tao，ZHANG Jing，WU Jingfang，et al.Department of Surgery，The First Hospital of Zhangjiakou City，Hebei，Zhangjiakou 075000，China

【Key words】Trollius flavonoids; papillary thyroid cancer; Trefoil factor 3

甲状腺癌是头颈部常见的恶性肿瘤，病理类型以乳头状癌最为多见，其恶性程度、淋巴结转移与否影响手术方式及术后生存率。金莲花有效成分总黄酮具有抗菌、抗病毒、抗氧化作用，能够抑制肿瘤生长。三叶因子3(trefoil factor 3，TFF3)是一类具有三个环状结构的多肽，主要由黏液分泌细胞分泌，是重要的黏膜保护和修复因子。有研究发现，三叶因子家族在肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达［1－3］，具有促侵袭、抗凋亡、促血管生成等作用。课题组前期研究发现TFF3在甲状腺乳头癌组织中表达明显升高，与肿瘤分级和淋巴结转移具有相关性［4］。

本研究采用不同浓度金莲花总黄酮作用于体外培养甲状腺乳头癌K1细胞，应用MTT法检测对细胞增殖的影响，采用Western blot和Real-time PCR检测K1细胞TFF3蛋白及mRNA表达变化，探讨金莲花对甲状腺乳头癌细胞的影响以及TFF3作为甲状腺乳头癌诊断标记物的可能性。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器人甲状腺乳头癌K1细胞由河北北方学院形态学实验室赠予。金莲花总黄酮由河北北方学院生命科学中心赠予。1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司)，MTT(Solarbio公司)，TFF3小鼠抗人单克隆抗体(Santa Cruze)，β-actin兔多克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司)，HRP标记羊抗兔IgG(北京康为世纪生物科技有限公司)，单链cDNA合成试剂盒(GenecopoeiaTM)，RealmasterMix(SYBR Green)(天根生化科技有限公司)，ECL发光试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Tanon-5200化学发光成像系统，实时荧光定量

PCR仪qtower2.2(德国耶拿公司)，Multiskan FC酶标仪(Thermo Fisher上海仪器有限公司)。

1.2金莲花总黄酮金莲花总黄酮40mg溶于100ml PBS中，高压灭菌15min，4℃保存。1640培养液将金莲花黄酮稀释，设0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg/ml 7个不同浓度。

1.3 K1细胞培养细胞用含10%胎牛血清的1640培养基，37℃、5% CO2条件下培养。取对数生长期细胞接种于96孔板，用不同浓度金莲花总黄酮处理不同时间。

1.4 mTT法检测金莲花总黄酮对K1细胞的抑制作用取对数生长期密度为5×104/ml的K1细胞，接种于96孔培养板，100 μl/孔，边缘孔用无菌PBS填充。5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入不同浓度的总黄酮，100 μl/孔，设6个复孔。5% CO2，37℃分别培养24、48、72 h后每孔加入20 μl 0.5%mTT溶液，继续培养4 h后终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490 nm处测量各孔的吸光值，计算药物对细胞的增殖抑制率。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜)。抑制率=(1－OD加药/OD对照)×100%。

1.5 Western blot检测不同浓度金莲花总黄酮对K1细胞TFF3蛋白水平的影响K1细胞以每孔25×104个细胞数接种于6孔板，次日分别加入0.8、1.6、6.4mg/ml金莲花总黄酮溶液，5% CO2，37℃孵育48 h，提取细胞蛋白，BCA测蛋白浓度，每孔50 μg蛋白质样品进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜(60 V恒压，TFF3:30min，β-actin:90min)，奶粉封闭，孵育一抗(TFF3为1∶500，β-actin为1∶5 000)，4℃过夜，加入辣根过氧化物标记的山羊抗鼠/兔抗体(1∶5 000)，ECL发光显色，Image J分析条带灰度，以目的蛋白的条带灰度与β-actin的灰度比值表示蛋白的表达水平。

1.6 Real-time Quantitative PCR(QPCR)检测不同浓度金莲花总黄酮对K1细胞TFF3mRNA水平的影响细胞培养及药物加入同上(1.5 Western blot检测)，提取细胞RNA，反转录成cDNA，按照Real-time PCR试剂盒说明配制预混试剂，设定程序进行Real-time PCR反应。结果以delta delta CT方法来计算，表示TFF3mRNA表达水平。TFF3、β-actin引物由北京赛百盛生物工程技术有限公司合成。TFF3上游引物5’-AATGCACCTTCTGAGGCACCT-3’，下游引物5’-CGTTAAGACATCAGGCTCC AGA T-3’;β-actin上游引物5’-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCGGACT CGTCATAC-3’。

1.7统计学分析应用SPSS 18.0统计软件，计量资料以±s表示，各组数据行ANOVA方差分析及q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1金莲花总黄酮对K1细胞生长抑制率的影响

MTT实验结果表明，同一时间不同浓度总黄酮均对K1细胞生长增殖抑制率随着药物浓度的增高而升高(P＜0.05)，不同时间，同一浓度总黄酮对K1细胞抑制率随时间延长而升高(P＜0.05)。见表1。

表1　MTT法检测金莲花总黄酮对K1细胞生长增殖抑制率的影响x±s

表1　MTT法检测金莲花总黄酮对K1细胞生长增殖抑制率的影响x±s

注:相同时间点，与前一个浓度比较，*P＜0.05;相同浓度，与前一时间点比较，#P＜0.05

药物浓度(mg/ml)24 h　48 h　72 h 0 0 0 0 0.4　 0.14±0.04*　0.21±0.05* #　0.28±0.06* #0.8　 0.23±0.06*　0.31±0.05* #　0.40±0.07* #1.6　 0.37±0.06*　0.48±0.07* #　0.58±0.11* #3.2　 0.44±0.07　0.54±0.08#　0.64±0.08#6.4　 0.59±0.11*　0.64±0.09* #　0.79±0.07* #12.8　 0.75±0.10*　0.76±0.07*　0.85±0.05*#

2.2 Western blot检测TFF3蛋白结果结果显示TFF3蛋白条带位于9 kDa处，内参β-actin反应条带位于42 kDa处。TFF3蛋白条带在随药物浓度升高颜色依次变浅。TFF3反应条带半定量分析结果显示随着加药浓度的升高TFF3蛋白表达量依次减少(P＜0.05)。见图1，表2。±s2.3 QPCR检测TFF3mRNA结果应用Real-time Quantitative PCR检测不同浓度金莲花总黄酮对甲状腺乳头状癌细胞K1细胞TFF3基因表达变化的影响。基因的溶解曲线呈单峰(图2，3)，说明引物特异性好，扩增产物单一。采用△△CT相对定量法计算基因拷贝的倍数变化，公式为: F =2－［(待测组目的基因CT 值-待测组内参基因CT值)－(对照组目的基因CT值

－对照组内参基因CT值)］。设定未加药组(0mg/ml)倍数变化为1，其他浓度计算值为0mg/ml的倍数，随着药物浓度的升高，TFF3mRNA表达逐渐降低。见表3。

图1　TFF3蛋白Western blot检测结果

表2　Western blot检测金莲花总黄酮对K1细胞TFF3蛋白表达的影响

图2　β-actin融解曲线

图3　TFF3融解曲线图

表3　Real time PCR检测金莲花总黄酮对K1细胞TFF3mRNA的影响

3　讨论

近几年甲状腺癌在全世界发病率呈上升趋势。根据病理分型，甲状腺癌可分为乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)、滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma，FTC)、未分化癌(undifferentiated thyroid carcinoma，UTC)及髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)，其中乳头状癌较为常见，目前治疗方法主要为外科手术切除+碘131内照射治疗+甲状腺素替代治疗，而中药辅助治疗恶性肿瘤已成为国内外抗癌药物研究的重要内容，能抑制肿瘤生长并避免西药所产生的不良反应。金莲花属于毛莨科金莲花属金莲花的干燥花及花蕾，具有清热解毒的作用，现代药理进一步研究表明金莲花主要有效成分黄酮类对人乳腺癌细胞，人结肠癌细胞，人食管癌细胞增殖具有抑制作用［5－7］。本实验采用MTT法测定金莲花总黄酮对人甲状腺乳头癌K1细胞生长抑制率，结果表明在同一作用时间条件下，金莲花总黄酮对K1细胞的抑制率呈剂量依赖性，而同一浓度条件下随着金莲花总黄酮作用时间的延长，对K1细胞增殖的抑制效果呈逐渐加强趋势，有效的验证了金莲花总黄酮在体外抑制甲状腺乳头癌细胞增殖的效果。

三叶因子家族(trefoil Factor Family，TFF)是由三个成员(TFF1、TFF2、TFF3)组成，它们蛋白质结构中具有同源的P结构域，即由6个高度保守的半胱氨酸残基形成的3个分子内的二硫键使整个肽链扭曲形成三叶状结构，因此它们具有耐热、抵抗蛋白酶的作用，三叶因子在胃肠道黏膜中分布较多，能够促进细胞增殖、迁移，是重要的黏膜保护因子［8］。TFF3定位于人21号染色体［5］，是近几年发现的与各种类型恶性肿瘤的发展关系较为密切的因子之一，在恶性转化的细胞中其促增殖、促分裂、促迁移的作用促进了细胞的转化，肿瘤的发生、发展，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成等方面发挥作用［9］。Kannan等在对TFF3与乳腺癌细胞抗雌激素抵抗的关系研究中发现，外源性转染TFF3能促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成，而通过RNA干扰抑制TFF3表达能减少肿瘤细胞的数量及克隆形成的数量，TFF3对肿瘤细胞的影响是通过Bcl-2细胞凋亡途径进行调节的［10］。本课题组前期对TFF3在甲状腺乳头癌组织中表达的研究发现TFF3蛋白和mRNA高表达率与甲状腺乳头癌TNM分期和淋巴结转移有关，可作为诊断PTC的参考指标［4］。

本研究从体外实验角度进一步检测了不同浓度金莲花总黄酮对K1细胞TFF3的表达变化的影响，结果表明随着金莲花总黄酮浓度升高K1细胞增殖率降低，TFF3蛋白及mRNA水平也随之下降，从体外实验证明了TFF3与甲状腺乳头癌细胞增殖关系密切，但是仍需要进一步验证是否是因为金莲花总黄酮能够抑制TFF3表达从而导致细胞增殖下降。

参考文献

1 may EE.The potential of trefoil proteins as biomarkers in human cancer.Biomarkmed，2012，6:301-304.

2 Vestergaard EM，Borrem，Poulsen SS，et al.Plasma levels of trefoil factors are increased in patients with advanced prostate cancer.Clin Cancer Res，2006，12:807-812.

3 Babyatskym，Lin J，Yio X，et al.Trefoil factor-3 expression in human colon cancer livermetastasis.Clin Expmetastasis，2009，26:143-151.

4张小俊，吴靖芳，黄静，等.三叶因子3在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义.解剖学报，2013，44:503-508.

5孙黎，程建贞，罗强，等.金莲花黄酮对K562、HeLa、Ec-109、NCIH446细胞增殖的影响.郑州大学学报(医学版)，2009，44:981-983.

6宋家乐，李贵节，赵欣.金莲花总黄酮诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡机制的研究.现代食品科技，2014，30:7-12.

7朱登祥，安芳，王书华.金莲花中荭草苷和牡荆苷对人食管癌细胞生长及凋亡的影响.中国老年学杂志，2013，33:4472-4475.

8 Aikou S，Ohmoto Y，Gunji T，et al.Tests for serum levels of trefoil factor family proteins can improve gastric cancer screening.Gastroenterology，2011，141:837-845.e1-7.

9 mhawech-Fauceglia P，Wang D，Samrao D，et al.Trefoil factor family 3(TFF3)expression and its interaction with estrogen receptor(ER)in endometrial adenocarcinoma.Gynecol Oncol，2013，130:174-180.

10 mhawech-Fauceglia P，Wang D，Samrao D，et al.Trefoil factor family 3(TFF3)expression and its interaction with estrogen receptor(ER)in endometrial adenocarcinoma.Gynecol Oncol，2013，130:174-180.