血小板聚集功能检测在冠心病治疗中的应用

2016-01-25郭峥，安健

中西医结合心脑血管病杂志 2016年7期

关键词：血栓冠心病检测

郭　峥，安　健

1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.山西省心血管病医院

血小板聚集功能检测在冠心病治疗中的应用

郭峥1，安健2

1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.山西省心血管病医院

摘要：冠心病病人心血管事件的发病机制与血栓形成密切相关，而血小板聚集是导致血栓形成重要过程。如今，抗血小板治疗在冠心病预防及治疗方面起着重要作用，其核心机制是降低血栓事件的发生率。其中对抗血小板药物进行血小板聚集功能检测，据检测结果指导冠心病个体化治疗有着重要临床意义。现对目前常见的几种血小板功聚集能检测方法及其临床指导意义综述如下。

关键词：冠心病；血小板聚集功能；检测；血栓；心血管事件

近年来，冠心病在我国呈逐年上升的趋势，且发病年龄趋于年轻化，其中急性冠脉事件的发生严重威胁着人民的生命健康[1]。冠心病病人急性冠脉事件核心发病机制与冠状动脉粥样硬化斑块不稳定及血栓形成密切相关，而血小板聚集是导致血栓形成重要过程。目前国内外各项研究表明，由于血小板抵抗存在，即便给予充分抗血小板治疗，仍出现心血管血栓事件[2]。

因此，据血小板聚集的检测结果，指导个体化抗血小板治疗才能明显的减低病人心血管血栓事件的发生率。

血小板聚集是血小板主要功能之一，是指相邻的血小板之间相互黏着成血小板团块的过程。其原理是致聚物把血小板激活后，使得糖蛋白Ⅱb/Ⅲa分子上的纤维蛋白原受体暴露，在Ca2+作用下GPⅡb/Ⅲa和纤维蛋白原及vWF结合，进而导致相邻的血小板相互聚集，其中起桥梁作用的是GPⅡb/Ⅲa 分子[3]。血小板聚集功能在血小板血栓形成过程中发挥着关键作用。目前血小板聚集功能检测是在体外模拟体内状况，在全血或富含血小板血浆中加入诱聚剂(ADP、花生四希酸、胶原等)刺激血小板上相应的受体，诱导血小板聚集，并对其聚集功能水平进行评价的方法。不同个体、不同状态(如用抗血小板药前后及对药物的敏感程度不同)，血小板反映出不同的聚集功能状态。因此该项检测结果不仅可以评价血小板的总体功能，同时也可以直接反应使用抗血小板药物病人的药效情况。根据临床需要，当前检测血小板聚集功能方法包括比浊法、流式细胞术、剪切诱导血小板聚集测定法、散射性粒子检测法、全血电阻抗法、发色底物/发光物聚集法、快速血小板功能分析仪(VerifyNow)、血栓弹力图等[4]。现对目前常见的几种血小板功能检测方法及其临床指导意义做一概述。

1比浊法

1.1定义比浊法(light transmittance aggregometry，LTA)，是1960年由Bron首次提出的血小板功能检测方法。其原理是通过设备将光浊度信号变化转变为电讯号的变化，然后通过记录仪记录描计曲线，计算得到最大的血小板聚集率[5]。不同诱聚剂通过产生各自独特的血小板聚集曲线，评价不同抗血小板药物的药效情况。

1.2功能比浊法具有方便、快速、经济等优点，所以在临床应用比较普及，因此被称为“金标准”[6]。同时比浊法也存在诸多缺陷，如样本需求大；人工操作步骤多导致结果误差大；重复性差；离心等操作导致样本中血小板性质和数量的变化；同时也导致血液中部分细胞的丢失，进而不能准确反映体内血细胞之间的相互作用；影响因素多，如高脂血症、高血糖等[7]；敏感性差，不能检测较小的(5个血小板以下)血小板聚集物，因而此方法特别适用于血小板功能低下的检测[8]。因为比浊法存在上述诸多不足，所以应该积极寻找具有操作步骤简便、敏感性好的检测血小板聚集功能的方法。

2流式细胞术(flow cytometry)

2.1原理随着检测技术不断发展，血小板聚集功能的检测方法也随之步入一个新的阶段。其原理是在体外通过ADP活化全血或富血小板血浆(PRP) 血小板聚集，进而应用特异的荧光抗体 CD61 perCP 标记已活化的血小板，然后进行流式细胞术分析，在特定的波长激发光照射下，经过染色细胞发射出特殊荧光讯号，最后通过探测器收集，传入计算机分析。其结果是应用单个血小板数量的减小来评估血小板聚集功能[9]。

2.2全血法流式细胞术优点此方法与受检者体内环境较为相似；具有较高的重复性；FCM 敏感性高于浊度法，能分析单个或亚群血小板膜活化标志物的测定；本法不使用同位素，没有放射性污染；保证检测的特异性[10]。同时此方法也存在诸多缺陷，如手工操作步骤多；检测费用高；此过程需在 45 min内操作完成；不可床旁操作；由于血小板大小不等，可能存在因为聚集体大小仍在设定的分界线之内，导致检测结果可能偏低。虽然此方法存在着诸多不足，但在血小板聚集功能检测方面也是新的进展。

3剪切诱导血小板聚集测定法

3.1原理剪切诱导的血小板聚集(shear-induced platelet aggregation，SIPA)是指血液在流动过程中因力学变化产生的剪切力导致血小板聚集，其在生理止血的过程中发挥着重要作用[11]。其原理是：利用圆锥的不断旋转产生剪切力，通过改变转速的快慢控制剪切力的大小，进而促进血小板聚集，聚集的血小板引起PRP的透光度变化，最后通过特殊仪器绘制成聚集曲线[12]。

3.2应用在动脉性血栓(如心梗和脑血栓等)形成过程中把剪切力诱导产生的血小板聚集当做一个重要的病理因素从而引起临床的高度重视[13]。血小板的活化被认为是脑血管动脉血栓性疾病的病理过程中重要始动因素。老年人的血管基本上都存在动脉粥样硬化或退行性变化，血管的局部狭窄处往往导致血流高切力；另外，血流在狭窄处或分叉处易产生湍流，同时动脉内的血流本来是潮汐式流动，血小板承受的切变力并不恒定，并且经常变动，因此剪切诱导的血小板聚集最易在这些部位附近发生，是导致血栓形成主要原因之一。综上所述探讨剪切诱导的血小板聚集及针对其制定相应的对策对血栓性疾病的防治具有重大意义，另外且较LTA法测定更为稳定。但温度和血小板数目对此法检测结果都有较大的影响，此外技术操作较复杂、价格相对昂贵，在基层医院推广有困难。

4散射性粒子检测法

散射性粒子检测法是应用血小板在聚集过程中散射光的变化来进行检测，而其散射强度由血小板聚集块大小及数量这2个指标共同决定。通过聚光镜把半导体激光( 波长 675 nm)折射转化成宽度约50 μm的带状光束，然后照射到装有 PRP比色杯。此方法与比浊法相似：首先静脉血被枸橼酸钠抗凝，通过离心分离得到PRP和PPP，接着将PPP透光率调到100%，然后把PRP注入比色杯，加入诱聚剂，最后通过经聚光镜折射后产生的带状光束照射，测定其聚集率。

此方法是通过聚集块的大小及数量这2个指标来测定散射光的强度和分布情况，评价血小板的凝聚功能。由于此方法不仅可以检测出小凝聚块，而且具有分别判断大、小凝聚块功能，因此在肾上腺素诱导聚集现象中应用此方法，便可推断肾上腺素导致血小板的聚集过程，首先是产生小凝聚块，通过小凝聚块融合成大凝聚块。同时，仍存在自然凝聚检出功能。自然凝聚的测定是指在不加任何诱聚剂的情况下测定体内血小板是否存在轻度活化。自然凝聚现象在正常人体内几乎不存在，而2型糖尿病病人中存在此现象约占40%[14]。

5全血电阻抗法

电阻抗法(impedance platelet aggregometry，IPA)是1980年Cardina和Flower[15]利用电阻抗原理检测全血血小板聚集功能的方法。其原理是测定经过稀释的抗凝全血的血小板聚集功能，应用记录仪准确的记录血液电极间电流或电阻的变化而形成的曲线，通过仔细观察体外血小板聚集情况来评价血小板聚集功能。

全血阻抗法优点：使用全血；样本少，全血中有红细胞、白细胞等同时存在，更能准确反映血小板在体内的功能状态；针对血液标本，能够克服因浑浊对检测结果的影响[16]；操作简便快捷，同时也减少误差，提高准确率；可床旁操作。其最大不足之处：设备保存条件要求严格，每次测定后必须清洗电极，连接电极的电线小心放置；对小聚集物的形成不敏感，导致其难以满足临床工作的需要。

6快速血小板功能分析仪(VerifyNow)

VerifyNow血小板检测系统(Accumetrics 公司，美国)是对病人负荷剂量6 h和服用维持剂量 5 d后 1 h进行血小板抑制水平测定。其原理应用花生四烯酸、ADP及凝血酶受体激活肽分别对阿司匹林、P2Y 12 受体拮抗剂及GPI抗血小板药物的血小板反应情况进行评估，其检测原理与 LTA 法基本一致，并且可用全血作为样本，另外检测程序无手工操作，避免误差，提高准确率。VerifyNow系统可提供3个关于血小板活性的基本参数：①血小板残余活行，反映在氯吡格雷或阿司匹林抑制作用下血小板剩余的活性程度；②血小板基线活性，以特定试剂作为激活剂，其反映了血小板最大的活性程度；③血小板抑制率，即血小板活性被有效抑制的程度。以上三者关系可表示为PRU/ARU=血小板基线活性×(1-抑制率)。以 P2Y 12 反应单位(PRU)为检测数值，依据PRU>240定义为氯吡格雷低反应组，PRU≤240为正常反应[17]。阿司匹林反应单位 (ARU)表示，ARU >550 定义为阿司匹林低反应性[18]。

优点有操作简便、快速(约3 min)、应用全血、需血量少、重复性强，可用于急诊、床旁检测，而且与 LTA具有很好的一致性；缺点无调效方法，国内检测费用较高，普及程度较低。

7血栓弹力图 ( thrombelastography ，TEG)

TEG是由 Harter[19]于 1948年发明，之后很长一段时间都应用于实验室研究，直到20世纪 80年代才由美国匹兹堡的 Kang 首次在临床肝脏移植手术中应用此技术，主要是鉴别凝血系统的紊乱及指导术中输血。如今 TEG 在各项手术中已广泛应用，如肝脏移植、心脏搭桥等。主要作用是监测围术期凝血功能，评估术中出血风险，指导术中输血[20]。目前TEG在国际上已被大量用于冠心病抗血小板治疗中，评价血小板的活性和抗血小板药物的药效情况等[21]，而国内研究较少。由于TEG敏感性低、受肝素等因素影响，近年来对其进行了一定的改良。改良后的 TEG 避免肝素影响，同时也增加其敏感性和重复性，使TEG得到更加广泛的应用。如今，血栓弹力图(thrombelastogram，TEG)不仅是血小板聚集率的检测工具，并且也能评估缺血事件发生的风险。血栓弹力图的工作原理：在凝血开始时，由于血块在形成和溶解过程中受到牵拉作用被悬挂的金属探针所感应，进而带动金属探针的转动，使其在转动过程中产生的一系列信号，最后由电脑程序处理上述信号得到血液凝固血小板图。其血小板图不仅可以反映阿司匹林低反应也可以反映氯吡格雷低反应，指导临床治疗。

TEG具有优点：样本为全血；血栓弹力图灵敏度高，检测过程15 min[22]，可评估病人出血风险[23]，重复性好，可床旁操作，设备保存条件方便，价格相对便宜。对 TEG 的准确性有待进一步评估，主要影响因素有：标本存放时间、测定方法、温度、性别、糖尿病等。血栓弹力图作为一种新型的血小板聚集功能的检测方法，在具体方法和结果判定上，目前国内外尚缺乏统一评价标准，还需更大规模、更加深入的研究来确立其标准。

8基因检测

另外近期一些研究报道了 CYP2C19 酶功能缺失变体等位基因的载体以及细胞色素 P450 同种型参与了氯吡格雷的新陈代谢，成为它的活性代谢物，导致局部缺血事件发生的风险增加[24]。

基因检测氯吡格雷是一种前体药物，口服后经肠道吸收，受ABCB1基因编码的转运体P-糖蛋白(P-gp)调控，约85%的氯吡格雷由醋酶转化为无活性的梭酸代谢物(SR26334)，只有不到15%的氯吡格林经肝脏细胞色素P450 (CYP450)酶系统(主要包括CYP2C19、CYP3A4和CYP3A5等)代谢为活性代谢产物(一种硫醇衍生物)。肝脏CYP2C19基因编码的酶蛋白是体内氯吡格林活化代谢过程中的关键酶，氯吡格雷在形成中间代谢产物2-氧-氯啦格雷及最终活性代谢产物的2步氧化过程中，分别有45%和20%是由CYP2C19基因编码的CYP2C19蛋白介导[25]。目前国外相关研究证实：在急性冠状动脉综合征或支架置入术后的冠心病病人中，CYP2C19功能缺失等位基因携带者与氯吡格雷低反应性及不良临床预后有显著相关性[26]相关研究报告显示：遗传因素有种族和地域差异，CYP2C19功能缺失等位基因携带者的频率在高加索白种人群中占35%～45%，在非裔黑种人群中占25%～35%，在亚洲黄种人群中占50%～70%，其频率是高加索白种人群的近2倍[27]。因此亚洲人更应据CYP2C19基因检测结果指导其个体化治疗。

8展望

血小板聚集功能检测的意义不仅是在显著降低缺血事件发生率同时不增加出血发生的风险，更是为了找到血小板抑制作用的最佳界值点[28]。如今血小板聚集功能检测的方法已从传统的手工法转变成全自动仪器法，从较早的比浊法转变成流式细胞术、剪切诱导血小板聚集测定法、血栓弹力图等，从应用富含血小板血浆( PRP) 样本转变成以全血为样本，从单一的检测血小板聚集功能转变成可同时测定血小板内Ca2+含量和血小板释放 ATP，从实验室到床旁检测法。

虽然目前血小板聚集功能测试的方法有很多种，但因为检测的标准不同，各种试验方法各有利弊，所以迄今为止国内外对抗血小板治疗反应多样性的临床检测和处理仍无一致意见。结合目前已经公布的多个大型研究所得到的结论不推荐对血小板聚集功能行常规检测指导个体化治疗。因此无论是2013年美国心脏病学会基金会(ACCF)/ 美国心脏协会(AHA)STEMI 指南[29]，还是2012 年 ACCF/AHA[30]及2011 年欧洲心脏病学会 (ESC) 的非 ST 段抬高冠状动脉综合征 (NSTE-ACS)指南[31]一致认为目前血小板聚集功能检测的作用尚未明确，不建议常规使用。我国专家共识提出：对常规剂量氯吡格雷治疗时发生了支架血栓或血栓事件如心肌梗死；临床和介入手术结果预测血栓风险明显增高(如肥胖、糖尿病、肾功能不全、术中出现夹层、无复流等)；左主干、单支开放血管(左主干等同病变)、多支血管病变、桥血管病变及弥漫病变需多枚支架重叠置入等高危病变PCI术后等高危人群提供相应血小板聚集功能检测[32]。近期一些研究报道 CYP2C19 酶功能缺失变体的等位基因载体以及细胞色素 P450 同种型参与了氯吡格雷的新陈代谢，成为它的活性代谢物，导致缺血事件发生率增加。相信在不久的将来，最佳的预测缺血事件和出血等临床结果的模型是基因基础(如 CYP2C19)和血小板功能测试的联合使用综合评价。

血小板抑制作用最理想的范围会因不同人群，不同病情而变化的，这些个体化的抗血小板治疗方案则是急需研究解决的问题。另外迫切需要将来血小板聚集功能的检测方法朝着更精确、便捷，多功能的方向发展，从而在临床疾病的诊断和治疗过程中发挥更有价值的指导作用，尤其据检测结果对冠心病及行PCI术后病人提供个体化治疗和减低心血管血栓事件的发生率。

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(本文编辑王雅洁)

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