附睾微环境对精子成熟影响的研究进展

龚 坚综述 刘朝圣审校

1.湖南中医药大学2013级硕士研究生（长沙　410208）；2.湖南中医药大学中西医结合学院



附睾微环境对精子成熟影响的研究进展

龚 坚1综述 刘朝圣2审校

1.湖南中医药大学2013级硕士研究生（长沙410208）；2.湖南中医药大学中西医结合学院

20世纪60年代Bedford［1］和Orgebin-Crist［2］根据实验结果，提出了附睾精子成熟的理论，睾丸产生精子并不成熟，缺乏运动和精-卵结合能力，精子在附睾中的成熟不是自发和时间依赖的，而是通过与附睾蛋白相互作用来完成的。研究表明，不仅附睾分泌蛋白参与精子成熟过程，而且是附睾内多种因素共同作用于附睾精子促使精子成熟。附睾精子和睾丸精子妊娠实验结果表明，睾丸精子组种植率及妊娠率低于附睾精子组，可能与睾丸精子缺乏成熟、影响胚胎进一步发育有关［3］，进一步验证了附睾微环境对精子成熟的影响。本文就精子成熟过程中附睾微环境的影响进行了文献综述。

一、精子在附睾内成熟

睾丸中产生的精子从其形态结构和染色质的角度已基本成熟，但还不具备运动能力，精卵识别以及牢固的结合能力。精子在附睾中的成熟是一个高度程序化的过程，一方面受到精子自身因素的作用，另一方面则受到了附睾微环境的影响。精子在附睾移行过程中，精子各部分也在发生着一系列的变化，如精子胞质小滴的移行，胞浆、顶体等精子的形态发生了进一步的变化；精子核染色质的浓缩，对核酸酶的抵抗力增强；精子膜的膜脂、膜蛋白、膜上糖基成分、膜电荷以及膜流动性与通透性的改变；精子运动能力、受精能力的获得；异常的精子逐渐被吞噬、吸收或降解等［4， 5］。精子从睾丸到附睾经历了一系列的物理、化学和形态的改变，从而最终获得完全成熟。

二、附睾内影响精子成熟的因素

（一）附睾分泌蛋白与精子成熟

现今对附睾精子成熟的研究已深入到分子生物学水平，热点是与附睾精子成熟微环境相关的一些特异性蛋白表达及基因调节的研究。目前己知附睾可以分泌约200种蛋白质［6］，其中一些蛋白已被确认直接参与了附睾中精子的成熟，但它们中的大多数在雄性生殖中的作用还未明了。这些蛋白质与管腔液的其他成分形成不断变化着的管腔微环境，与精子相互作用，使精子表面蛋白的成分得以部分改变或部分修饰，从而被激活或抑制从而逐步获得成熟时所具备的功能。

1. 附睾分泌蛋白与精子运动能力的获得：精子的运动能力是在附睾成熟过程中获得并得到发展的，包括超激活运动和前向运动。

有研究表明，附睾特异分泌蛋白EPPIN表达与精子浓度、精子活力呈显著负相关，它能结合精囊蛋白（semenogelin， Sg）和纤连蛋白（fibronectin，Fn），通过在精子表面形成的外壳蛋白抑制精子获能及精子的活动性［7］。其中，EPPIN-Sg可以调控精子内部的pH值及钙离子水平，进而抑制精子的活动率，影响生殖［8， 9］。体外模型研究证明，前向运动蛋白（FMP）是未成熟精子在附睾内成熟获得前向运动的必需蛋白［10］，当FMP结合在附睾精子的尾部时，精子能获得前向运动能力，当FMP结合在附睾精子顶体时，能防止精子间的头部凝集［11］。有报道，中性α-糖苷酶活性与精子活力之间有显著的正相关性，与不运动精子有显著的负相关性，因此推测其与精子前向运动能力有关［12］；其可能的机制是中性α-糖苷酶可催化精子糖原降解，供给精子代谢与运动能源。此外β-防御素15［13］、β-防御素3（HBD-3）［14］参与精子活力和前向运动能力发生，在附睾内精子成熟方面发挥重要作用。

2. 附睾分泌蛋白与获能、顶体反应、精卵结合：精子获能是指精子在获得穿透卵子透明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要阶段；顶体反应是指精子释放顶体酶，穿过透明带的过程。精子质膜上有一些具黏附作用的蛋白参与到精子获能、顶体反应以及其后的精卵融合过程过程中，存在于精子和卵子上的蛋白质复合物具有结合和融合作用，一些附睾分泌的精子结合蛋白参与了这个过程。

附睾分泌蛋白P34H大多与精子膜顶体部位结合，可作为附睾精子成熟的标志物，能够介导精子和透明带的结合，当附睾中P34H降低时可发生原发性男性不育［15］。精卵聚合蛋白通过与卵质膜的相互作用，破坏卵质膜的稳定性，促使精子穿卵过质膜，完成受精［16］。附睾特异蛋白丝氨酸蛋白酶抑制剂（HongrES1）特异地表达于附睾尾段，在附睾精子移行时结合到精子顶体前区，精子获能使HongrES1蛋白脱落，顶体反应后完全消失，起到去能因子的作用［17， 18］。此外，人附睾蛋白SOB2，FLB1，gp20， Ecad等也参与了精卵融合过程。

3. 附睾分泌蛋白与免疫保护及抗菌能力：附睾分泌的蛋白中，有些能够结合在精子表面，保护精子在男性和女性生殖道内免受细菌或病毒的攻击，从而促进精卵作用，在附睾精子成熟过程中发挥重要作用；防御素家族就是其中的代表。

防御素家族成员Bin1b特异地表达于附睾头部，能与精子头部结合；在对成长中大鼠的研究发现，30d的大鼠附睾才发现Bin1b的表达，在性成熟时表达量达到高峰，老年时逐渐减少。这种区域特异性和发育阶段特异性的表达方式提示Bin1b在精子成熟和生育方面可能有重要作用。而利用附睾头部上皮细胞的原代培养物和反义实验已证实了Bin1b的抗微生物作用［19］。防御素家族其他成员如：HE2［20］，EP2［21］和ESC42［22］也被证实具有较强的抗细菌、抗真菌作用。

hCAP18是一种在附睾从头部到尾部全程表达的分泌蛋白，是Cathelicidin家族成员，大量的表达于附睾尾部。已证实hCAP18具有强大抗菌作用［19］。同样在附睾尾部大量分泌的Lf蛋白，是一种金属转运蛋白，通过限制微生物摄取这些金属离子而发挥强大的抗菌、抗真菌、抗病毒效应，同时还具有抗肿瘤和抗炎症作用［19］。

4. 附睾分泌蛋白与抗氧化保护蛋白：哺乳动物的精子多富含不饱和脂肪酸，因而极易受到氧自由基的损伤。附睾分泌的抗氧化损伤的物质可以保护附睾管腔内移行成熟和储存的精子。

附睾管腔液中谷胱甘肽（GSH）介导的保护作用在附睾内是很活跃的，通过对谷胱甘肽过氧化物酶5基因敲除小鼠模型的研究表明，谷胱甘肽过氧化物酶5是一种重要的管腔液自由基清除者，保护尾部精子自由基损伤，维持精子DNA完整性，保障男性生育能力［23， 24］。肉碱及其酯类是附睾中另一种活跃的抗氧化物质，它能通过两种途径发挥其抗氧化作用：一条途径是通过阻止活性氧（ROS）产生，清除自由基，保护精子细胞免遭氧化损伤［25］。另一条途径是通过清除细胞内过多的乙酰辅酶A，或替代进入质膜磷脂中的脂肪酸，以及增加花生四烯酸的分解代谢，从而有效发挥其抗氧化和修复作用［26-27］。

（二）附睾内细胞因子与精子成熟

附睾内的细胞因子是由睾丸间质的巨噬细胞受到外界刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物活性的小分子蛋白质，通过与受体结合等途径在附睾内参与精子的发育与成熟［28］。

由T细胞产生的巨噬细胞移动抑制因子（MIF）具有垂体激素、免疫调节剂和分裂素等功能。研究发现MIF作为一种附睾上皮细胞因子大量存在于附睾中，参与精子在附睾中的成熟过程，可能与附睾精子获得运动能力有关［29-31］。肝细胞生长因子（HGF）在附睾的体部及尾部能高度表达，它对附睾精子的受精能力和运动能力的启动有着重要作用；研究发现，它参与附睾精子的运动能力的获得［32］。

（三）微量元素与精子成熟

微量元素能通过多种途径影响精子的生成、成熟；有研究表明，不育症患者精浆中微量元素含量与精液参数存在密切的相关性［33］。其中，附睾中的锌离子、钙离子对附睾精子成熟影响最大。

1. 锌离子： 附睾中一些促进精子成熟的酶是锌金属酶，锌缺乏可导致这些酶功能异常。有研究表明，精浆中锌离子含量与精子顶体酶活性呈正相关；因此，锌离子能通过对精子顶体酶活性的作用影响精子成熟过程［34］。而另一种锌金属酶：山梨糖醇脱氨酶，可将山梨醇转化为果糖为精子提供能量，因此，山梨糖醇脱氨酶活性与精子运动性相关［35］。可见附睾中锌离子含量对精子成熟有着重要作用。

2. 钙离子：已有研究表明精子的Ca2+聚集作用对精子成熟、获能和顶体反应起主导作用，进而直接影响雄性受精和生育力［36， 37］。附睾特异肽Bin1b通过激活钙离子通道促进Ca2+吸收，引发未成熟精子获得运动能力［38， 39］。实验证明Bin1b通过激活精子L型Ca2+通道，进而为未成熟精子获得运动力提供必需的Ca2+汇集，Ca2+与精子鞭毛中的钙调蛋白相互作用激活磷酸二酯酶，降低精子内cAMP的浓度，从而调控精子活力［40-41］。

（四）其他

1. 活性氧：氧的代谢产物及其衍生物的含氧物质统称为活性氧类（Reactive Oxygen Specie，ROS），包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基、单线态氧和一氧化氮等。在生殖系统中，ROS的产生是一种正常生理情况。附睾微环境中适量活性氧可以调节精子功能， 研究表明，适当水平的ROS在精子生理学方面起着重要作用，如O2-、H2O2和NO与精子高活跃性运动、获能以及顶体反应有关，ROS引起的脂质过氧化作用促进透明带结合［42］。但过多活性氧会导致氧化应激发生，造成精子质膜不饱和脂肪酸氧化，严重影响精子质膜流动性，危害精子获能、精卵识别和受精过程，同时破坏精子DNA和鱼精蛋白之间紧密包装状态，引起 DNA 断裂，碱基缺失，父方遗传信息完整性无法保障，常引起不育或者围产期流产［43］。

2. 酸性环境：近年来有研究表明，无论是基因突变还是环境因素所导致的附睾管腔酸性环境的破坏均可引起精子成熟障碍和雄性不育。因此，附睾管腔内pH值改变可以影响精子的成熟［44-45］。当精子进入女性生殖道后，在获能过程中，位于质膜上的精子特异性Ca2+通道1（CatSper1）促进Ca2+的内流，使得精子尾部呈“鞭打”运动，CatSper1的激活依赖于碱性环境，而附睾管腔内酸性环境以及HCO3-的浓度则会阻滞CatSper1的激活，阻止精子在附睾的提前获能［46］。附睾上皮细胞通过各种酸碱转运体调节HCO3-的重吸收和质子的分泌，共同维持了附睾管腔酸性微环境的平衡，为附睾精子成熟提供了适合的环境。

结　语

近年来随着研究的深入，越来越多的影响附睾精子成熟的因子及机制被发现，附睾与避孕及男性不育的关系也显得越来越重要。尽管对附睾内环境的附睾分泌蛋白、细胞因子、微量元素等作用机制的研究取得了一定的进展，但还有许多问题尚未解决。有别于传统对睾丸精子研究的重视，随着附睾微环境对精子成熟影响研究的深入，将为以附睾为目标的男性不育防治及男性生育调控方法提供基础理论依据。

致谢：本文由湖南省科技计划项目（2012SK3138），国家自然科学（81373641）项目资助。

关键词附睾； 微环境； 精子成熟； 细胞因子；附睾分泌蛋白

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.017

参 考 文 献

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（2015-11-11收稿）

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