HBV准种与肝细胞癌发生发展关系的研究进展

任静静综述 邓伟审校

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部；2广西壮族自治区肿瘤防治研究所

综述

HBV准种与肝细胞癌发生发展关系的研究进展

任静静1综述 邓伟2审校

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部；2广西壮族自治区肿瘤防治研究所

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）为一嗜肝细胞性DNA病毒，具有复制率高、突变率高的特点，在宿主体内以准种形式存在。HBV感染不仅可以引起隐匿性、急性和慢性病毒性肝炎，还与肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生发展密切相关。关注HBV准种的研究，有助于从整体和动态的角度认识HBV基因突变的特点、规律及其生物学特性，进而探究HBV准种与HCC发生、发展的关系，为早期预防、早期诊断和合理治疗提供新策略。本文就HBV准种与HCC发生发展的关系作一综述。

乙型肝炎病毒；准种；肝细胞癌；肿瘤发生；基因变异

乙型肝炎病毒（hepa t i t i s B v i r u s，H BV）感染是导致慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌（hepa t o c e ll u l a r c a rc inoma，H CC）的重要原因。H CC严重威胁人类的生命健康，据全球癌症最新数据（G l o b o c an 2012）估计，H CC已经位居全球恶性肿瘤死亡第2位，是死亡率较高的恶性肿瘤之一。在2012年全球H CC死亡病例中，超过50%的死亡病例发生在中国［1］。感染H BV者比未感染H BV者发展为H CC的风险高30倍，据估计全世界53%H CC患者与H BV感染有关［2］。因此，H BV相关H CC的防治仍然是我国一项重要的课题。H BV病毒学研究的进展以及相关检测技术的发明，使我们对H BV病毒的结构、功能、生物学特性有了更深入地了解，尤其是在H BV准种的概念提出来之后，研究人员对H BV的感染、复制过程和遗传异质性有了新的看法，认为H BV准种群之间核苷酸的差异会影响病毒感染后的疾病进程和结果。本文就H BV准种与H CC发生发展关系的研究进展作一综述。

1 HBV准种的概念和特点

H BV是嗜肝逆转录D N A病毒，基因组结构由一个共价闭合环状双链D N A组成（c o v a l en t cl o s e dc i rc u l a r D N A，ccc D N A），全长约3 200 b p。以ccc D N A为复制模板，在宿主R N A聚合酶作用下，转录成含有H BV D N A序列上全部遗传信息的前基因组R N A（p r egenomi c R N A，pg R N A），pg R N A进入肝细胞质，在H BV自身的D N A逆转录酶作用下，合成负链D N A，再以负链D N A为模板合成正链D N A，形成子代的部分双链环状D N A。同时，以ccc D N A为模板转录成几种不同长短的m R N A，在细胞质中翻译合成编码蛋白，经包膜蛋白包裹组装成成熟的病毒颗粒向细胞外分泌，进入新的复制周期。H BV复制过程中有逆转录过程，其逆转录酶缺乏D N A聚合酶的3′-5′校正功能，导致较高的错配率，其逆转录错配率大于10-5核苷酸替换/位点/年，这种复制错误率高于其他D N A病毒，与进化相对较慢的R N A病毒相似。因此，大量的病毒变异产生了受自然选择作用的高度异质性种群。这种遗传学上高度相关但序列不完全相同的变异株组成的混合体，即准种（q ua s i s pe c ie s）。

H BV准种这一概念最早于1993年提出，是指H BV全基因序列异质性界定在2%～5%之间，不足以构成新的基因型或血清型。准种是H BV的自然存在方式，一直在演变，当病毒生存的外界环境发生变化时，存在于宿主体内的准种优势变异株容易通过筛选，能更好地适应新环境，符合经典的达尔文进化理论—适者生存。H BV准种具有以下特点：⑴H BV准种普遍存在于慢性乙型肝炎患者体内;⑵准种可见于H BV全基因序列，有普遍性和个体化的双重特点［3］，以H BV C区、S区、核心启动子等免疫攻击主要靶点尤为多见［4］；⑶H BV基因组易发生变异，并在长期进化过程中不断累积，形成了具有种族和地域差异的H BV准种，其与乙型肝炎慢性化、H CC的发生、H BV免疫逃逸和耐药等密切相关。因此，H BV病毒许多重要的特征不能用一个仅有的共有序列解释，对于病毒种群里存在的微变异体需要更多了解。

2 HBV准种演变的动力学因素

病毒变异是准种产生的根本原因，是准种不断演变的使动因素，因而变异的复杂性决定了准种的复杂性。目前发现H BV准种动态变化的原因主要来自三个方面。首先是病毒自身的原因，包括R N A聚合酶缺乏校对功能、H BV复制活性高、突变率高、聚合物区域的错误、基因微小及O RF重叠等［5］。其次是宿主方面的原因，例如宿主的一些AP O BEC-3蛋白可以联合H BV衣壳调节病毒高突变基因的产生［6］。此外还可能来自于化学损害，包括脱氨基、脱嘌呤、脱嘧啶作用，与氧自由基的反应，直接或间接的电离辐射，光化学反应等。已经发现病毒自身的变异、宿主的免疫压力及抗病毒药物的应用是影响病毒准种构成的主要因素。H BV病毒自身的变异表现为核苷酸错配［7］；宿主的免疫压力影响主要表现为H BV的免疫逃逸；抗病毒药物对H BV准种的影响表现为慢性H BV感染者使用抗病毒药物治疗时，H BV准种所处的环境较为复杂，优势株和劣势株处于不断演变和进化中，通过对环境的适应性变化而被筛选下来。

3 HBV准种与HCC发生发展的关系

3.1 H BV准种复杂性与肝脏疾病严重程度的关系

H BV准种是遗传学上具有异质性的变异体，这些同时存在的变异体可能有助于病毒的持续和致病。目前的研究表明H BV准种的相互作用可能增强H BV复制，减弱宿主的免疫反应，可潜在促进肝病的急剧恶化和肝衰竭的发生［8］。研究者通过对乙肝患者组织标本进行H BV D N A分析发现，慢性乙肝患者病情越严重，H BV基因前C/C区准种的发生率越高；通过采用单链构象多态性（SS CP）和D N A序列分析法对慢性乙型肝炎不同疾病类型患者S区准种检测及准种复杂性进行分析，发现随病情加重，H BV准种的复杂度会增加。M a t he t等［9］采用同样方法分析发现肝硬化患者体内的H BV准种复杂度高于慢性乙型肝炎患者，同样认为随病情加重，H BV准种的复杂度增加。刘霖等［10］采用PCR-构象敏感凝胶技

术，对慢性乙型肝炎患者H BV前C/C及BCP区进行研究，发现慢性H BV急性发作时H BV准种复杂度较低，而病情好转时准种复杂度较高。温志立等［11］对H BV感染的慢性携带者和慢性乙型肝炎重度患者血清采用熔点曲线法分析，发现慢性乙型肝炎重度患者携带的H BV准种数量多于慢性携带者，提示H BV准种与乙型肝炎临床表现存在一定关系。姚碧莲等［12］通过对慢性H BV携带者、慢性乙型肝炎患者和慢性乙型肝炎肝硬化患者R T区进行克隆和测序分析发现，H BV准种复杂度肝硬化组＞慢性乙型肝炎组＞慢性携带者组，三组间有统计学差异，提示慢性H BV感染过程中免疫清除期比免疫耐受期具有更宽的H BV变异谱，随着病程延长，H BV准种越复杂。以上研究结果均提示，H BV准种复杂程度与疾病严重程度呈正相关，复杂的H BV准种可能导致病毒持续感染，进一步诱发肝细胞损害。

3.2 H BV准种突变位点分布与H CC的关系

3.2.1 X基因变异与H CC的关系 X基因负责编码H BV X蛋白（H B x），它的功能目前还不完全清楚。有文献表明H B x在H BV感染的持续和H CC的发展中起一定作用［13］。X基因区最常见的突变是发生在基本核心启动子区（BCP）的核苷酸A1762T/G1764A双突变，它可导致X蛋白羧基功能区2个密码子（130、131）发生改变，氨基酸分别由赖氨酸变为蛋氨酸，缬氨酸变为异亮氨酸（K130M和V131I）。有研究表明这些突变可以降低H B e A g的合成，增强H BV-D N A的复制水平，形成H B e A g阴性的慢性H BV感染，进而可能发展为H CC。目前已报道与 H CC有关的突变有C1653T、T1753V、C1773T、G1386M、G1613A、A1727G、T1485、B1499、A1757/T1764/G1766和T1766/A1768［14～18］，他们单独或联合可作为H CC发生的预测指标。近年来研究发现增强子Ⅱ/核心启动子区域的 T1653、V1753和T1762/A1764突变、基因亚型C2/C e、H BV D N A水平≥4l og10拷贝/m L是H CC发生的独立危险因素［19，20］。

3.2.2 PreC/C基因变异与H CC的关系 P r e C/C区基因主要编码核心蛋白（H B c A g）和e蛋白（H B e A g）。C区突变并不是随机分布，而是聚集在主要组织相容性复合体Ⅱ限制区域，这些突变和H CC显著相关。例如C区氨基酸变异 c P5H/L/T、c D32N/H、c C/E43K、cI9 7F/L、c L100I、c A131G/N/P、c S181H/P、c C/Q182K/s t op、c P50A/H/Y和c E83D，均与H CC发生有关［21］。P r e C区最常见的突变是1 896位核苷酸G突变为A，也就是P r e C区第28位氨基酸发生G1896A突变，这一过程可产生一个终止密码子（T AG），妨碍H B e A g的合成［22］。有研究［23］发现在H B e A g阴性患者体内，单核苷酸替换G1896A与H CC进展有关，而在H B e A g阳性患者体内，单核苷酸替换G1899A与H CC进展有关。Z hang等［22］通过对192名慢性乙型肝炎病毒患者的全基因进行研究，证实G1896A突变是导致疾病发展的一个重要因素，G1776A突变会导致H B e A g阴性和高病毒载量，这种患者发展为肝硬化和H CC的概率更高。此外C1913A或C1914T、A2149C/T、A2188T/C、C2198A、C2444A/T突变已被报道与H CC密切相关［21］。

3.2.3 P基因变异与H CC的关系 P基因编码病毒H BV D N A聚合酶/逆转录酶。P基因区最常见的突变是Y M DD突变。Y M DD突变主要由拉米夫定引起，常常是蛋氨酸（M）被异亮氨酸（I）或缬氨酸（V）取代，即Y M DD突变为Y I DD或Y V DD而引起严重肝脏病变。H o s a k a等［24］研究发现，与拉米夫定有关的Y M DD突变是H CC的独立危险因素。另有研究［25］已在肝硬化和H CC患者中检测到自发型Y M DD突变，且H CC患者较肝硬化患者发生自发型Y M DD突变率更高。

3.2.4 PreS1/S2/S基因变异与H CC的关系 基因组S区被划分为S、P r e S1和P r e S2三个区域，主要功能为编码H BsA g。近年来在韩国男性H CC患者P r e S1区发现W4P/R突变的存在［26］。目前发现某些前S基因缺失株（P r e S1缺失、P r e S2缺失）的累积，可发生肝脏损害甚至H CC［27］。K ao等［28］研究发现H CC患者P r e S缺失发生率明显高于慢性携带者，其主要聚集在C-末端P r e S1和N-末端P r e S2序列。此外，已证实T770C突变（基因库编码A Y206393）与H CC进展明显有关。

4 展望

对H BV准种的深入研究使我们从患者体内整个病毒群体水平上认识H BV的生物学特性和意义，使研究者对H BV的认识更加全面。通过研究“肝炎-肝癌”疾病各阶段演变过程中H BV准种的动态变化及致癌优势株的存在情况，有望为肝癌筛查中高危人群地确定提供新的思路。在抗H BV治疗前用高灵敏的方法检测个体病毒准种的组成，尤其进行耐药病毒株的检测，对临床制定有效的个体化抗病毒治疗方案有指导意义。对慢性乙型肝炎患者，可以通过检测患者体内病毒准种的组成，与已检测出的H CC高危突变株作对比，以便早期检测出致癌优势株，进行早期干预、早期治疗，改善患者预后，提高生存质量。

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［2016-06-20收稿］［2016-07-12修回］［编辑 江德吉］

R735.7

A

1674-5671（2016）04-14

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.04.13

国家自然科学基金资助项目（81260319）；广西高校科学技术研究资助项目（KY2015ZD025）

邓伟。E-mail：9608946@qq.com