多发性硬化及EAE动物模型相关信号通路研究进展

孙哲　郭力　孔鹏

多发性硬化及EAE动物模型相关信号通路研究进展

孙哲郭力孔鹏

050000河北省石家庄市河北医科大学第二医院神经内科 神经病学河北省重点实验室

摘要:多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质脱髓鞘为主要病理特点的慢性炎性自身免疫性疾病。CD4+T淋巴细胞介导的对自身髓鞘抗原产生的免疫应答为其可能的发病机制。目前公认小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)为研究MS的动物模型。目前关于MS的治疗尚缺乏有效方法，近年研究发现多种信号通路在MS/EAE中发挥调控作用，通过研究MS/EAE中的相关信号通路及相关通路靶点药物的干预效果，将对MS的治疗起到启示性作用。本文就有关MS/EAE相关信号通路的研究进展做一综述。

关键词:多发性硬化；脑脊髓炎，自身免疫性，实验性；MAP激酶信号系统；信号传导

CD4+T淋巴细胞介导的对自身髓鞘抗原产生的免疫应答为多发性硬化(MS)及小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的可能发病机制，其中辅助性T细胞(helper T cells，Th)1和Th17尤为重要。Th1细胞分泌干扰素γ(gamma interferon，IFN-γ)，Th17细胞分泌白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)，这些细胞和炎性反应因子渗入中枢神经系统(CNS), 破坏血-脑脊液屏障，导致大量的免疫细胞被募集到CNS。这些激活的免疫细胞产生大量的IL-12、 IL-6、IL-17、IL-21和IL-23等炎性反应因子，破坏神经元和少突胶质细胞，造成局部脱髓鞘和轴索损伤[1]。MS/EAE的发病与一些信号通路密切相关，其中丝裂元活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路、蛋白酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAKs/STATs)通路与细胞分化密切相关；NF-E2相关因子/抗氧化反应原件(NF-E2-related factor 2/anti-oxidant response element，Nrf2/ARE)通路与减少氧化应激有关；Toll样受体/核因子κB(toll like receptors/nucleus-κB，TLRs/NF-κB)和腺苷酸活化激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)通路调节一系列炎性反应因子的表达；Rho/Rho激酶(Rho/Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)通路可以抑制轴突再生，增加血-脑脊液屏障通透性；自噬相关通路通过调节细胞自噬影响病情严重程度。以相关信号通路为靶点治疗对缓解MS/EAE病情有重要意义。

1MAPK通路

MAPK级联反应是细胞内的重要信号传导系统，可引起特异基因表达的开启或关闭。该信号通路主要包括p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，c-JNK)和细胞外信号调节酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)。其中p38 MAPK通路在Th17细胞分泌IL-17过程中起到重要作用；JNK通路介导肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)诱导成人少突胶质细胞死亡，影响初始T细胞向Th1细胞分化；ERK通路在诱导型调节性T细胞(induced regulatory T cells，iTregs)发育中发挥重要作用。

1.1p38 MAPK信号通路 p38 MAPK被上游MAPK激酶(MAPK kinases，MKKs)3和MKK6激活，在巨噬细胞和树突细胞中通过反转录后机制和转录机制调节炎性反应因子(如TNF-α、IL-6等)[2]。另外，p38 MAPK 信号通路在调控Th17分化为IL-17的过程中起重要作用。p38存在四种同分异构体：p38α、p38β、p38γ、p38 δ，一项微阵列研究表明，MAPK14(编码p38α)的表达在MS的CNS损伤部位提高了5倍[3]。另外，有研究结果显示在小鼠EAE模型炎性反应细胞和CNS胶质细胞中p38 MAPK磷酸化水平增加[1]；而应用p38 MAPK抑制剂的小鼠和基因敲除p38α的小鼠Th17细胞功能受损，EAE严重程度降低[4-5]。相反，在增加p38 MAPK活性的转基因小鼠体内，T细胞连续特异性表达MKK6，促进了IL-17的分泌和加重了EAE的严重程度[4]。综上，p38 MAPK信号通路在MS/EAE 的致病中发挥了重要作用。

目前已发现一类吡咯咪唑类复合物可以结合于p38 的Thr175 位点, 可与ATP竞争性结合p38蛋白, 从而特异性抑制p38 MAPK途径。

1.2JNK信号通路 经炎性反应因子刺激后，JNK激酶(JNK kinase，JNKK)1/MKK4或JNKK2/MKK7 介导JNK上Thr183和Tyr185磷酸化，使JNK完全活化为磷酸化的JNK(phosphor-JNK，p-JNK)并具有酶催化活性[6]。陈瑜等[7]研究发现，EAE小鼠与正常小鼠相比，脑组织中p-JNK表达量明显增加，并且髓鞘脱失越严重，p-JNK表达量越大。这可能与JNK激活介导的TNF诱导少突胶质细胞死亡有关[8]。另外，使用JNK抑制剂可以阻碍初始T细胞向Th1细胞的分化，表明c-JNK 调节前体细胞向Th1 和Th2 效应细胞的分化过程。

Joh等[9]研究发现，在雄性癌症小鼠腹膜巨噬细胞体外培养中，常春藤苷可通过抑制JNK通路减少NO、TNF-α和COX-2的表达。

1.3RAS/ERK通路 iTregs和Th17均为CD4+的辅助性T细胞，iTreg对炎性反应有抑制作用，而Th17则可以促进炎性反应。ERK在iTreg的发育过程中发挥主要作用。研究发现，经转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)刺激下的CD4+T细胞可明显增加ERK的活性，加入ERK抑制剂可明显减弱EAE小鼠体内TGF-β抗原标记的CD4+T细胞Foxp3 的表达，但对Th17的分化影响不明显。这也解释了为何ERK敲除小鼠EAE易感性更高[10]。更多的研究发现RAS阻断剂可以增加小鼠脾细胞来源的iTreg数量及增强其功能[11]。

2JAK/STAT通路

JAKs是 STATs信号转导通路上游激酶，当其活化后诱导胞浆中单体STATs分子磷酸化，形成STATs二聚体，并转移到核内调控基因表达。此通路在CD4+T细胞分化过程中起重要作用。IL-12引起的Th1细胞分化是由JAK2和STAT4介导；IL-4引起的Th2细胞分化由JAK1/3和STAT6介导；JAK2/STAT3通过调节维A酸相关孤儿素受体γt(retinoid acid related orphan receptor γt，RORγt)和IL-23R转录因子的表达，影响Th17细胞的分化；JAK1/2和STAT1调控IFN-γ对巨噬细胞的作用；另外，JAK1/2和STAT3与IL-6家族信号相关[12]。全基因组相关研究表明，基因编码的JAK/STAT通路中的成分在MS患者中显著表达[13]。在EAE 发病过程中，STAT1、STAT3和STAT4被大量激活[12]。

抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)蛋白家族是近来发现的一类可反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子，对JAK/STAT 途径具有负反馈调节作用。Frisullo等[14]研究发现 MS的复发与SOCS3的降低和STAT3激活增加有关。与普通EAE小鼠相比，具有转基因表达SOCS3树突细胞的EAE小鼠疾病严重程度下降，并且Th1和Th17细胞的分化受限，Th2细胞分化增加[15]。有研究表明辛伐他汀可直接以MS患者的树突状细胞为靶点，诱导SOCS1和SOCS3的表达, 减少STAT1和STAT3的活化，从而减少树突状细胞表达IL-1、IL-23、TGF-β、IL-21和IL-12水平，为Th1和Th17的分化提供了抑制性内环境[16]。这一发现为治疗MS提供了新思路。

3Nrf2/ARE 通路

氧化应激在神经脱髓鞘疾病中扮演至关重要的角色，Nrf2/ARE通路因其减轻氧化应激的作用而备受关注。

Nrf2是细胞抗氧化应激中调节各种抗氧化应激酶表达的关键因子，由 Neh1～Neh6 结构阈组成，其中 Neh1 上含有特有的碱性亮氨酸拉链结构(basic leucine zipper，bZIP)，可与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合；Neh2 可与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap-1)高度紧密结合[17]。氧化应激等可导致Nrf2与Keap-1解离和释放，Nrf2与Keap-1解离后转位进入细胞核，进而和ARE结合，启动下游基因的转录。

Nrf2诱导的下游靶基因HO-1是重要的抗炎酶，其抗炎机制被认为是增加一氧化碳水平和抑制巨噬细胞的活性[18]。Nrf2激活剂可使Nrf2/ARE通路激活，增加HO-1、NQO-1等抗氧化酶或抗氧化物的表达。应用莱菔硫烷对EAE小鼠进行干预发现，其可增强Nrf2的活性，增加HO-1和NQO-1的表达，并且脑内氧化应激的衡量指标丙二醛水平有所下降[19]。

以Nrf2为靶点的药物有望用于MS等多种疾病的治疗，其中富马酸二甲酯已进入Ⅲ期临床研究。

4AMPK信号通路

在MS中，周围免疫细胞穿过血-脑脊液屏障进入CNS，形成炎性微环境。AMPK可调节炎性反应因子基因的表达。Meares等[20]研究发现AMPK的激活可减少INF-γ诱导的细胞因子和趋化因子的产生。INF-γ通过STAT1的激活来调控基因表达，敲除AMPK可导致STAT1的基础表达明显增加，INF-γ诱导的炎性因子也会增加，包括TNF-α、CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10，CXCL10)和CC趋化因子配体2(CC chemokine ligand 2，CCL2)。相反，AMPK的激活可阻碍INF-γ诱导的STAT1的表达。表明AMPK通过调控INF-γ/STAT1轴影响病情。EAE小鼠在发病初期及发病高峰时，AMPK信号通路活动下调，CNS内INF-γ及CCL2表达增加。AMPK兴奋剂AICAR或二甲双胍可减轻EAE病情，表明AMPK在EAE中为保护性因素。另有研究表明AMPK可以通过抑制STAT3的磷酸化调控IL-6的表达[21]。

5TLRs/NF-κB通路

TLRs是机体启动天然免疫的关键,并在天然免疫与获得性免疫之间架起桥梁。研究TLRs在MS和EAE中的作用,对寻找MS治疗的新靶点有着重要意义。

TLRs一旦被病原相关分子模式(pathogen-associated molecule patterns，PAMPs)激活,即可触发细胞信号级联，最终激活NF-κB的信号途径从而激活细胞，启动一系列免疫炎性反应。NF-κB可介导IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ等各种细胞因子的分泌，与自身免疫性脱髓鞘疾病和其他神经变性疾病的发生有密切联系。TLR2和TLR4可诱导IL-1、IL-6和IL-12的产生，这些细胞因子促使初始T细胞向Th1和Th17分化，并分别分泌INF-γ和IL-17。IL-17/INF-γ诱导淋巴细胞通过血-脑脊液屏障，造成CNS损伤。在MS患者的脑组织和脑脊液中可发现多种TLR2配体[22]。

在TLRs信号传导途径中,髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)的激活是其关键。van Loo等[23]研究发现，完全抑制MyD88依赖途径中NF-κB的上游激活物NF-κB必需调控因子(NF-κB essential modulator，NEMO)可改善EAE小鼠CNS炎性反应和组织病理损伤。抑制NF-κB可阻止促炎性细胞因子、趋化因子以及血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表达。

6Rho/ROCK通路

Rho在介导抑制轴突再生、增加血-脑脊液屏障通透性过程中起重要作用。Rho是ROCK最直接的上游刺激信号，肌球蛋白及内收蛋白等是ROCK主要的下游靶分子，ROCK激活可促进肌丝收缩。

ROCK信号通路激活后，可调节细胞骨架的重组，为细胞迁移提供动力，促进内皮细胞骨架蛋白收缩, 使血-脑脊液屏障通透性增加。T淋巴细胞穿过血-脑脊液屏障，攻击髓鞘造成脱髓鞘改变。炎性细胞通过血-脑脊液屏障迁移到中枢神经组织的过程是CNS 炎性脱髓鞘病发生的关键始动因素[24]。这表明Rho/ROCK信号通路推动了EAE的疾病进展。ZHANG等[25]研究发现，反应性巨噬细胞和 T细胞是RhoA的重要细胞来源，RhoA调控巨噬细胞和 T细胞在EAE中的功能。由此推测RhoA以及ROCK表达上调在EAE发病过程中起重要作用。

7自噬相关通路

研究证明，自噬与自身免疫性脱髓鞘有关，特别是自噬相关基因5(autophagy related gene 5，Atg5)可调节T细胞的存活和分化。Atg5在MS患者脑组织中过度表达，并且外周血中Atg5水平与临床病情严重程度呈正相关。另外研究发现EAE小鼠T细胞中Atg5 mRNA水平增高[26]。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白受体(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin receptor，PI3K/Akt/mTOR)是调节自噬的重要通路。PI3K是Akt/mTOR信号通路的上游分子，可以分为两种类型，I型PI3K活化时通过激活Akt/mTOR信号通路负性调节自体吞噬，Ⅲ型PI3K活化时激活Beclin-1，启动自噬进程。当细胞受生长因子等刺激后，PI3K活化，进而磷酸化其底物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)使其转化为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)与同源性底物蛋白质结合后使Akt磷酸化，Akt磷酸化激活后，使结节性硬化复合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)磷酸化，继而阻止TSC1/2 复合物形成，激活mTOR复合物1(mTORC1)，mTORC1激活后通过磷酸化Atg13，导致其不能与Atg1 结合，从而阻断自噬[27]。

雷帕霉素通过抑制mTORC1而激活自噬，并且雷帕霉素可以缓解EAE/MS病情。而在MS患者中自噬相关基因Atg5高表达，表明自噬活跃。有关自噬在MS中的具体机制及雷帕霉素影响MS的详细机制仍需进一步阐明。

综上所述，MS的发病机制复杂，多种信号通路参与其中，并形成了相互交叉的复杂信号通路网络。这些信号通路可为MS的治疗提供新的靶点，具有重要的研究意义。是否还有未发现的信号通路，多种通路之间的相互关系是什么及多靶点的治疗效果如何，这些问题尚未明确，仍需进行大量基础和临床研究。

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(本文编辑：时秋宽)

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.015

通讯作者：郭力，Email：guoli6@163.com

中图分类号：R744.5+1

文献标识码：A

文章编号：1006-2963 (2016)01-0058-05

(收稿日期：2015-07-02)