昼夜节律基因BMAL1在肿瘤中的研究进展*

瞿 波综述， 金 风审校

(1.贵州医科大学， 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院肿瘤科，贵州省肿瘤医院头颈肿瘤科， 贵阳 550000)

•综述与讲座•

昼夜节律基因BMAL1在肿瘤中的研究进展*

瞿 波1综述， 金 风2△审校

(1.贵州医科大学， 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院肿瘤科，贵州省肿瘤医院头颈肿瘤科， 贵阳 550000)

目的：昼夜节律基因在分子遗传学水平构成生物钟, 使得生物体的行为和内分泌、代谢及细胞分裂等各项生命活动呈现周期性、有序性和协同性。Brain and muscle arnt-like 1 (BMAL1)基因是昼夜节律基因家族中的一员，在细胞中的表达具有特定的节律和水平，BMAL1蛋白能与CLCOK(clock circadian regulator)蛋白形成异质二聚体，参与调控细胞节律性的变化，BMAL1基因的表达异常与肿瘤的发生、发展、治疗疗效及预后判断有着密切联系。

昼夜节律； BMAL1基因； 基因表达； 肿瘤

BMAL1(brain and muscle arnt-like 1)基因，也称做ARNTL(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like)基因,是哺乳动物生命活动中分子昼夜节律震荡器中的关键元件。BMAL1基因位于11号染色体短臂，编码蛋白质 BMAL1，属于 bHLH-PAS(basic helix-loop-helix-per-arnt-sim) 结构域转录因子家族，能够通过自身的表达调控和形成正负反馈通路而产生昼夜节律，最终使器官组织水平和细胞水平的生命活动高度有序协同。近年来大量研究表明，BMAL1基因在肿瘤的发生、发展、治疗疗效及预后判断中起着重要作用。BMAL1基因与肿瘤关系的进一步阐明可能带来对于肿瘤成因、播散和转移机制认识的深化, 并为临床肿瘤诊疗开创新模式提供理论依据。

1 昼夜节律基因BMAL1基因概述

几乎所有生物体的内在生理活动和外在行为都表现出一定的周期性，这种周期性生命活动现象被称为生理节律，其中以昼夜节律最普遍，研究最深入。昼夜节律的形成，主要是因为地球的自转引起24小时的光-暗变化，通过时间-信号输入通路，传递到下丘脑视交叉上核形成。昼夜节律具有遗传性，但是能够被光照、温度和摄食规律重新校正。昼夜节律是通过基因表达调控和实现的，目前在哺乳动物中发现至少有10种昼夜节律基因，分别是：BMAL1、PER(period circadian clock 1、2、3)、CLOCK(clock circadian regulator)、CRY(cryptochrome 1、2)、CKIε(casein kinase 1 epsilon)、NPAS2(neuronal PAS domain protein 2)和TIMELESS(timeless circadian clock)。

BMAL1 基因是10种昼夜节律基因的核心元件之一，通过正负反馈通路、自身的表达调控和其他辅助调节机制而产生昼夜节律。在正反馈通路中，BMAL1蛋白小泛素化修饰后，通过cAMP/Ca2+反应元件结合蛋白(cAMP/Ca2+response element binding protein-binding protein，CBP)，与CLOCK快速形成BMAL1/CLOCK异质二聚体[1]，该异质二聚体通过结合到启动子区的E盒上而激活PER、CRY转录，PER翻译后的蛋白质进入细胞质被CKIε磷酸化，磷酸化形式的PER是不稳定的，可以通过泛素化而降解，在负反馈通路中，CRY蛋白在细胞质中的积聚促进形成稳定的PER/CRY/CKIε复合物，该复合物进入细胞核后，CRY能够扰乱BMAL1/CLOCK介导的转录激活，导致BMAL1转录水平的降低及PER和CRY转录的抑制；BMAL1基因的转录活性还受其自身表达产物量的负调控，BMAL1/CLOCK异质二聚体在一定程度上可以抑制BMAL1的转录[2-3]，BMAL1/CLOCK通过mir- 142- 3p(microRNA- 142- 3p，微小RNA- 142-3p)作用于BMAL1的3’非翻译区，负反馈调节BMAL1的表达，形成BMAL1自我调控的负反馈环[4]；此外，BMAL1基因的活性调节是一个复杂的网络关联过程，它还受到其它许多因素的调节，如胰高血糖素-环磷酸腺苷效应元件结合蛋白和调节其转录活性的协同刺激因子2(glucagon-cAMP-response element-binding protein and its coactivator CREB-regulated transcriptional coactivator 2，Glucagon-CREB/CRTC2)信号级联放大通路可促进BMAL1表达[5]，核膜蛋白MAN1(one of inner nuclear membrane proteins)可直接与BMAL1的启动子结合而促进BMAL1的转录，从而将核外周和生物节律两大调节身体机能的系统相结合[6]。

2 BMAL1基因与肿瘤的关系

2.1 BMAL1基因作为抑癌基因

2.1.1 BMAL1基因与头颈肿瘤 BMAL1基因在几乎所有视交叉上核细胞、小脑颗粒层细胞及多数外周细胞中都有表达[7]，BMAL1的表达量受谷氨酸盐、年龄、性别等多种因素的影响，一旦改变某个因素，导致BMAL1的表达水平降低，则会引起机体正常细胞发生变化，从而在分子水平上为细胞的恶变创造条件。在BMAL1基因与头颈鳞癌的关系探讨中，通过分析40例头颈鳞癌病人9种节律基因的表达情况,发现和周围正常组织相比，癌组织中BMAL1基因表达水平明显降低，且临床分期越晚，BMAL1基因表达水平越低[8]。Jung等[9]通过过表达技术使BMAL1基因高表达后，发现胶质瘤细胞U251侵袭性减低，反之RNA干扰沉默BMAL1基因则可使胶质瘤细胞U251侵袭性增加，进一步分析其机制，发现BMAL1基因是通过抑制PI3K-Akt-MMP- 2 (phosphoinositide 3-kinase-Akt-MMP- 2)信号通路、拮抗致癌基因bcl-w而降低脑胶质瘤细胞的侵袭性。以上研究结果表明，BMAL1基因在头颈肿瘤的发生、发展中起重要作用，BMAL1基因可通过抑制PI3K-Akt-MMP- 2信号通路、拮抗致癌基因bcl-w，降低癌细胞的侵袭性而起到抑癌作用。

2.1.2 BMAL1基因与消化道肿瘤 目前关于BMAL1基因与消化道肿瘤的研究相对较多，大量研究表明BMAL1基因在消化道组织如肝、胃中的表达均具有节律性，其差异可能只在于表达水平和节律的时间性。在动物模型中，正常小鼠中BMAL1基因的表达具有节律性，而在BMAL1基因突变小鼠中，肿瘤自然发生或放疗后诱导的肿瘤发生率增加，在构建的小鼠结直肠癌模型中，瘤组织中BMAL1 mRNA的转录量低于周围正常组织和健康小鼠的结肠组织[10]。在人体中，分析对比结直肠癌组织和癌周正常组织，发现癌组织中10种节律基因的表达都发生了改变，BMAL1和PER的表达水平明显降低，表明BMAL1基因表达量的下降与结直肠癌的发生有很大的关系[11]。在构建的BMAL1基因沉默的结直肠癌细胞株中，Zeng等[12]发现沉默BMAL1基因会导致癌细胞增殖加速，从机制上分析，BMAL1基因能产生这样的效应是因为BMAL1基因表达受抑后，会抑制抑癌基因P53的表达，促进周期蛋白B1、D和E的合成，减少细胞的凋亡和DNA损伤，从而促进肿瘤细胞增殖，这一研究结果在后来再次被Sakamoto等的研究[13]证实，该研究证明BMAL1过表达能抑制癌细胞增殖，其机制可能是通过抑制周期蛋白D1的表达而阻止细胞从G1期到S期转化。Jiang等[14]在后来胰腺癌细胞株AsPC- 1和BxPC- 3的研究中，再次证实了BMAL1基因的抑癌作用，且进一步发现了其作用的机制是通过结合到P53基因的启动子上而促进肿瘤抑制通路的激活，从而起到抑制肿瘤细胞增殖和G2/M期阻滞的作用。这些研究结果都证实，BMAL1基因在一些消化道肿瘤中起抑癌基因的作用，BMAL1基因表达升高，可抑制肿瘤细胞的增殖，反之，若抑制BMAL1基因的表达，则会加速肿瘤细胞增殖，从而加快肿瘤的发展。

2.1.3 BMAL1基因与血液系统肿瘤 BMAL1基因在血液系统中的表达，也与肿瘤有着密切联系。正常成年人外周血淋巴细胞中昼夜节律基因CLOCK 和BMAL1 的表达存在同步化的昼夜节律性转录特征[15]，通过构建慢性时差这一昼夜节律紊乱模型，使BMAL1基因表达水平下降，导致对核因子kB(nuclear factor-kappa b，NF-kB)和微小RNA- 155(microRNA- 155，mir- 155)的抑制作用减弱，从而降低宿主的免疫力，为肿瘤的发生创造条件[16]。研究健康人群、新诊断慢粒患者和治疗后的慢粒病人外周血细胞中9种节律基因的表达情况，发现在健康人群外周血单核细胞和多核细胞中，9种节律基因具有相似的表达谱，而包括BMAL1基因在内的7种节律基因的表达模式在新诊断的慢粒患者及治疗后的慢粒患者中发生了明显改变，新诊断的慢粒患者，其BMAL1基因表达水平明显低于健康人群，而在通过甲磺酸伊马替尼治疗后达到细胞学完全缓解的部分病例中，这些基因的表达又可以慢慢升高，甚至达到正常水平，从而表明BMAL1基因的下降与慢粒的发生有着密切联系，BMAL1基因在慢粒中很可能起到抑癌基因的作用[17]。在一项关于慢性淋巴细胞白血病的研究中，Rana等[18]发现，相较于正常人群，慢性淋巴细胞白血病患者外周血中昼夜节律基因BMAL1的表达明显降低，而下游控制细胞周期进展的基因Myc和周期蛋白D1的表达则明显升高，该研究表明，节律基因BMAL1的缺失可以导致下游与细胞增殖和凋亡相关的靶基因的缺失，从而导致慢性淋巴细胞白血病的发生。以上研究都表明，BMAL1基因的低表达与肿瘤的发生有着密切联系，BMAL1基因在血液系统肿瘤中起着抑癌基因的作用。

2.2 BMAL1基因作为促癌基因

在一项关于胸膜间皮瘤与脏/壁层胸膜全基因组的差异性研究中，Røe等[19]发现，BMAL1基因在胸膜间皮瘤中高表达，随后，Elshazley等[20]的研究也证明，BMAL1基因在恶性胸膜间皮瘤中表达水平增高，沉默BMAL1基因会抑制细胞增殖和克隆形成，出现G1期细胞减少、G2/M期细胞增加等细胞周期紊乱的表现，引起胸膜间皮瘤细胞的凋亡和坏死，用苏木精和曙红对沉默BMAL1基因的恶性间皮瘤细胞ACC-MESO- 1进行染色分析，可以观察到细胞形态学的改变和细胞核的微核化、多核化及空泡改变；分析其机制，可能是因为沉默BMAL1基因引起细胞有丝分裂受抑，从而导致G1期细胞的减少，为了证明沉默BMAL1后有丝分裂异常的发生，镜下观察细胞变化，结果显示，正常细胞进入有丝分裂相时细胞变圆，接着胞质分裂，细胞一分为二完成分裂过程，而沉默BMAL1基因的间皮瘤细胞则不能正常完成分裂，出现细胞体积变大、微核等现象，从而表明胸膜间皮瘤细胞中，沉默BMAL1基因的结局是出现有丝分裂障碍及细胞凋亡，该研究表明，沉默BMAL1基因会导致细胞周期紊乱、细胞凋亡增加，提示BMAL1基因在恶性胸膜间皮瘤中很可能起到促癌作用。

2.3 BMAL1基因对肿瘤影响的复杂性

BMAL1基因对肿瘤的影响是极其复杂的，在不同肿瘤中，BMAL1基因可通过不同的机制影响肿瘤的发生发展，即使在同一类型肿瘤中，不同的微环境也可能使BMAL1基因发挥不同作用。在乳腺癌的研究中，有研究发现对于长期从事夜间工作的女性，如护士、女飞行员，BMAL1基因表达水平高于常规日间工作者，发生乳腺癌的风险明显升高[21]，分析其机制很有可能是由于夜间暴露于人造光下，导致褪黑素的产生减少，褪黑素减少一方面会增加RORα1的表达，从而增加BMAL1的表达，另一方面，通过增加雌激素水平和抑制抗肿瘤细胞增殖物质的作用，进而增加乳腺癌的发病风险[22]，然而，Zienolddiny等[23]通过研究上下夜班挪威护士的乳腺癌发病风险，发现BMAL1基因与乳腺癌发病之间的关系并不确切，对于连续4次夜班的实验者，BMAL1基因可能增加乳腺癌的发病风险，对于连续三次夜班的实验者，BMAL1基因则可降低乳腺癌的发病风险。也有研究表明，短暂的昼夜节律工作紊乱，不会导致人外周血中节律基因表达的改变，只有对于长期昼夜节律工作紊乱的人，才会出现节律基因表达的改变[24]，可见，BMAL1基因对肿瘤的影响是很复杂的，它可能通过不同的途径调控肿瘤细胞的增殖，只有彻底明白BMAL1基因发挥作用的机制，才能使其在临床上为指导肿瘤治疗提供依据。

3 BMAL1基因对治疗疗效的影响

Bjarnason等[25]在一项关于人口腔黏膜中节律基因的表达情况的研究中发现，BMAL1基因在口腔黏膜中的表达具有24小时的节律性，其表达峰值为早上、下午和夜间，随后Yang等[26]通过建立鼠口腔鳞癌模型发现，在开灯后4、16、22小时给予化疗药奥沙利铂能够明显提高治疗疗效和减少不良反应，从而延长小鼠生存时间和提高小鼠的生活质量，进一步分析可发现，开灯后4、16、22小时，相当于早上、下午和夜间，该时段BMAL1表达水平较高，从而推测BMAL1基因高表达时能明显提高治疗疗效和减少药物的毒性反应。随后，Zeng等[27]通过构建BMAL1基因过表达的结直肠癌细胞株，再次证实BMAL1基因过表达后能够增加结直肠癌细胞在体外和体内对化疗药奥沙利铂的敏感性，从而加强奥沙利铂引起的细胞凋亡，提高治疗疗效。

4 BMAL1基因对预后的影响

Zeng等[27]通过分析82例晚期结直肠癌患者癌组织中BMAL1基因的表达情况，发现BMAL1表达水平较高者总生存、无病生存时间明显长于BMAL1基因表达水平低者，具有较好的预后。临床上通过分析胰腺导管腺癌和癌旁正常组织中BMAL1基因的表达情况，发现BMAL1基因在癌组织中表达水平降低，且BMAL1表达越低者，其中位生存时间越短，表明BMAL1基因的低表达与临床病人的不良预后有着重要联系[28]。在头颈鳞癌病人外周血白细胞中，包括BMAL1基因在内的9种节律基因表达水平明显下降，通过分析头颈鳞癌患者术前术后节律基因表达水平变化及其与患者预后的关系，发现术后生存时间超过1年的患者，其CLOCK和PER表达水平逐渐升高，而对于术后生存时间短于1年的患者，其BMAL1、CLOCK等节律基因呈持续低水平状态，由此可以推测，包括BMAL1基因在内的昼夜节律基因有可能成为头颈鳞癌病人预后评估的循环标记物[29]。以上研究表明，BMAL1基因在头颈鳞癌病人的预后评估中起重要作用，BMAL1基因表达水平越低，可能提示不良预后。

5 结 语

BMAL1基因是昼夜节律基因的核心元件之一，能够通过自身的表达调控和形成正负反馈通路而产生昼夜节律。BMAL1基因的异常可引起正常细胞的细胞周期、细胞分裂和细胞凋亡发生变化，从而在分子水平上为细胞的恶变创造条件，参与肿瘤的发生；BMAL1基因可影响细胞侵袭性的高低及肿瘤分期早晚，影响肿瘤的进展；BMAL1基因可影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性而影响治疗疗效；临床上可通过检测病人外周血中BMAL1基因的表达水平来预测肿瘤发生的风险，通过治疗前后BMAL1基因表达水平的差异来判断一些肿瘤的预后情况。虽然BMAL1基因对肿瘤影响的研究取得了一定成果，但从前文可看出大家结论尚有争议，这可能与研究样本的数量、实验条件及研究者自身的原因有关。进一步深入研究BMAL1基因在肿瘤发生发展、治疗疗效及预后评估中的作用，阐明BMAL1基因在不同肿瘤中发挥作用的机制，可为认识肿瘤提供新视角,为临床肿瘤诊疗寻求新模式提供理论依据。

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2016- 01- 15

2016- 05- 02

*国家自然科学基金项目(81560437)

瞿 波(1989-)，女，湖北利川人，在读硕士研究生，主要从事头颈部肿瘤基础与临床研究。

△金 风，主任医师，教授，硕士生导师，E-mail:jinf8865@yeah.net

R730.231

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.03.009