间充质干细胞与缺血性心脏病

倪清蓉，洪环宇，孔 静，侯慧媛，梁宏亮，金振晓，刘金成



间充质干细胞与缺血性心脏病

倪清蓉，洪环宇，孔 静，侯慧媛，梁宏亮，金振晓，刘金成

［关键词］：缺血性心脏病；间充质干细胞

作者单位：710032，西安，第四军医大学学员一旅（倪清蓉，洪环宇），第四军医大学研究生管理大队（孔 静），第四军医大学第一附属医院眼科（侯慧媛），第四军医大学第一附属医院心血管外科（梁宏亮，刘金成）

缺血性心脏病是现代社会危害人类健康的重大疾病。心肌细胞是一种传统意义上的终末分化细胞，缺血坏死或凋亡后再生困难，因此，目前临床所有的再血管化治疗难以恢复已死亡的细胞。干细胞疗法为缺血性心脏病提供了新的思路。其中骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）获取相对容易，免疫源性低，不涉及道德伦理学及法律问题，在体外培养容易大量扩增且仍然保留“干细胞”特性，而成为修复损伤心肌的最佳候选细胞。

1　MSCs的定义、鉴定与生物学特性

骨髓MSCs约占骨髓有核细胞的十万分之一到一百万分之一。但是MSCs能够在体外大量扩增。目前国际细胞治疗协会根据以下标准来定义MSCs：①在稳定培养状态下贴壁生长；②表达CD73，CD90 和CD105等表面分子，但不表达CD34，CD45，HLADR，CD14，CD11b，CD79a，或者CD19等分子；③在体外培养体系中可分化为成骨细胞，脂肪细胞和成软骨细胞。研究发现MSCs可转分化为包括心肌细胞的中胚层来源细胞［1］。MSCs具有种属特异性，人MSCs和小鼠MSCs表达的细胞表面标志物存在一定的差异性。其中人和鼠的MSCs都表达CD29，CD51，CD73，CD90和CD105分子，但不表达CD31，CD45或者造血干细胞的标志物［2］。虽然Durairaj等报道小RNA21（miR-21）可以作为MSCs的鉴定标志物［3］，但鉴定MSCs的干细胞特性最可靠的实验依据仍然是诱导分化实验，即MSCs在体外培养时添加不同的诱导分化物质，能够分化为骨、脂肪、软骨等组织类型。

MSCs可以通过分泌多种细胞因子，如生长因子、白细胞介素（LI）等，还可以分泌mRNA，miRNA和外泌体等分子［4］。其分泌的细胞因子一般可以分为两类：第一类为有免疫调节功能的细胞因子，比如LI-1、LI-6、LI-7、LI-8、LI-11、LI-14和LI-15，巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子等［5］；第二类为与血管生成或血管发生有关的细胞因子，比如血管内皮生长因子（f vascular endothelial growth factor，VEGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胎盘生长因子、单核细胞趋化蛋白1等。值得注意的是，VEGF主要为促血管生长，而PEDF是VEGF的拮抗剂，主要为具有明显抗血管生成作用的因子。研究显示MSCs同时会产生这两种相互拮抗的因子，但两者表达量不同。在骨髓MSCs中，一般情况下PEDF的表达量高于VEGF；但在不同环境中，BM⁃SCs可以通过表达VEGF与PEDF的相对量不同，对血管的生成起着重要的调节作用［6］。

MSCs有独特的免疫学性质。首先，MSCs表达的多种分子在T细胞上都有相应的配体，比如：主要组织相容性复合物Ⅰ类分子（MHC-Ⅰ）、MHC-Ⅱ（低表达）、CD90，CD106，CD166等［7］，这说明MSCs可以刺激T细胞产生免疫反应。但MSCs的免疫原性很低。因为MSCs缺乏共刺激分子CD80 与CD86［8］，使得T细胞缺乏第二活化信号刺激而不能被激活。同种异体MSCs与自体MSCs在体内有相似的生物学效应，并且同种异体MSCs不被自体免疫系统排斥［9］。甚至有研究结果显示把异种MSCs移植于体内后仍不产生排斥反应［10］。这种独特的免疫特惠性使得MSCs在临床应用中有巨大的优势。另外，MSCs可以作用于辅助T细胞Ⅰ型（Th1）、Th2、自然杀伤细胞等多种免疫细胞，例如抑制T细胞的活性、抑制B细胞的增殖等，改变了这些细胞分泌细胞因子的特性。这些具有免疫抑制作用的特性在不同的动物模型中也同样可以检测出来，并且这种免疫抑制的作用可以通过MSCs具有的分泌许多免疫调节物质（LI-10，肿瘤生长因子-β）的能力加以合理解释。最新的研究表明，MSCs免疫调节的能力建立在细胞直接接触的基础之上，但是对于其与免疫细胞可能具有的生理相关性还需要进一步确认。

2　MSCs治疗缺血性心脏病的机制

在正常生理状态下心脏处于旧的心肌细胞死亡与新的心肌细胞生成的动态平衡之中。心脏作为人体中再生能力最弱的器官之一，只存在少量的心脏干细胞可以接受心肌凋亡或坏死后发出的信号分化成新的心肌。严重的心肌缺血如心肌梗死（myocar⁃dial infarction，MI）后，大量的心肌细胞死亡，仅依靠原位的干细胞的补充作用是不够的。而骨髓MSCs拥有多向分化、自我更新、增殖、免疫抑制及体外培养等优势成为最有希望运用于心脏缺血损伤临床治疗的干细胞。

2.1分化、旁分泌与促血管生成机制 体外研究表明，多种方法可诱导MSCs分化为心肌细胞，如5-氮胞苷、血管紧张素-Ⅱ等［11］，或与心肌细胞共培养、或直接注射入动物心脏中也可以实现。经过组织切片观察可证实分化细胞形态与心肌细胞几乎相同，并且通过移植到受损心脏的瘢痕处可以起到改善心脏功能，防止心脏病理重构，促进再生等的作用。不仅如此，MSCs还有刺激心肌干细胞再生的作用［12］。但也有研究发现移植入损伤处的MSCs的转分化能力不强。在定量的研究中，仅有0.5%～5%的移植细胞转分化为具有心肌细胞的表型［13］。这一研究结果与移植后心肌损伤处修复的状况不符，说明转分化机制可能并非是修复损伤的关键机制。

对于缺血损伤心肌的修复，关键因素是供氧通道的建立及恢复。MSCs的修复效果，间接证明MSCs促进了大血管和毛细血管网的重构。研究发现MSCs可以在培养后转分化包括内皮细胞和血管SMCs在内的血管细胞。当MSCs移植入心梗区域后，病变部位的病理生理性变化刺激MSCs转分化潜能，高表达CD31，vW因子，SM-肌动蛋白等血管细胞标志物，病变部位血管密度增加，心脏功能改善。MSCs向血管细胞转分化与病变部位的多种刺激因子等有关，并且MSCs的旁分泌机制可对血管生成有着重要促进作用。

如前文所述，MSCs可分泌多种抗细胞凋亡及促血管生成的因子。当MSCs移植于心梗动物模型病变处时分泌VEGF、bFGF、肝细胞生长因子（hepato⁃cyte growth factor，HGF）等，是构成修复微环境的重要因子。MSCs分泌的外泌体是一种大小为30～100 nm，由miRNA及胆固醇构成，磷脂分子包裹的囊泡状物质［14］。MSCs外泌体的这种结构可使其随意进入心肌细胞和上皮细胞，以发挥促血管生成、抗细胞凋亡及抗炎效应等一系列的心脏保护效应。其中它传递的miR-22和miR-221是已知的重要抗凋亡分子［14］。在心肌缺血损伤后，MSCs的外泌体也可减少嗜中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞的渗入。

2.2细胞融合与线粒体转移 MSCs移植后可在心梗处发现了原位细胞与供体干细胞融合的现象。Ac⁃quistapace等研究发现，在MSCs与成年鼠心肌细胞的共培养体系中，细胞的不同部分可通过一种“纳米管通道（TNT）”的结构进行联结融合。TNT结构包括了相互融合细胞的细胞膜及F-肌动蛋白［15］。这些发生融合的细胞表达了类似祖细胞的许多表型，即表现出了“重编程”的能力。同时发现移植的MSCs与邻近组织细胞的线粒体转移也可通过TNT实现，这一转移过程可有效地改善耗氧细胞中的线粒体损伤情况。并且MSCs与心肌细胞融合也建立线粒体转移通道，将正常功能的线粒体进行转移。虽然目前关于这一现象的体内实验证据尚未充足，随着研究进展，这可能是一个修复心肌损伤的重要机制。

除以上机制之外，MSCs本身具有趋化至损伤或炎症部位的能力。研究表明体外扩增的MSCs通过鼠尾静脉注入动物体内后，大部分细胞随后会被“招募”到损伤组织，如心肌梗死、创伤性脑损伤、肝纤维化变性、及各种类型的肿瘤部位等［16］。

3　MSCs治疗缺血性心脏病的临床研究进展

3.1移植方式 干细胞在病变组织中的留存比例是疗效的关键。MSCs可以通过外周静脉输注、开胸手术时直接心肌内注射、经冠状动脉内注射和直接心内膜下注射等方式进行移植。外周静脉注射是最简单便捷的方式，但是其留存率低，大多数细胞滞留于心肌组织外，因此，少被临床研究采用。经冠状动脉内注射保证了较高的移植剂量，而且与外周静脉注射相比，MSCs表现出了更明显的趋化向损伤心肌的“归巢”现象，所以这是临床试验中常用的方法。由于一些患者冠脉阻塞的限制，MSCs还可以通过冠状静脉窦注入［17］。手术时心肌内直接注射是多数研究推荐的移植方式之一，可以直接将MSCs注入MI部位，直接靶向目标组织，并且避免了间接方法中出现的许多复杂问题。但这一方法的弊端是其植入过程的侵入性损害，且可能会引发心率失常、栓塞等突发情况。组织工程技术是改善细胞移植效率的新兴策略。利用水凝胶、三维支架等生物材料培养MSCs获得了更好的细胞黏附性，细胞留存率提高，并创造了适合MSCs的生存、增殖及分化空间［18］。

3.2移植时机 MI后出现的炎细胞浸润、缺血再灌注损伤等会极大程度影响移植MSCs的存活率。同时，组织应激产生的VEGF，HGF等生长因子上调，又可促进移植MSCs的聚集、增殖及分化。如果移植时间过早，大量的细胞在不利的微环境中无法存活；如果移植时间过晚，病变组织不可逆的心肌损伤和血管重构会极大地限制移植效果。所以，在恰当的时间进行移植是保证细胞存活和移植疗效的重要因素。Collins等［19］利用绿色荧光蛋白标记的MSCs分别于MI后30 min，24 h及第5天心内膜下注射发现，MSCs的损失率由心肌梗死后24 h移植时的31%下降至第5天的1%。也有研究发现在MI 后1～2周移植细胞MSCs的存活率高于病变后1 h移植，且左心室功能有较明显的改善。而在MI后24 h进行移植，虽然不能明显改善心脏的收缩功能，但可以减小心脏的梗死面积［20］。因此，治疗最佳时机可能在MI后5～14 d。

3.3移植剂量 研究表明MSCs治疗心梗的剂量应达到108以上才可以实现对左心室射血分数（LVEF）的显著作用。Cliffold等［21］的统计分析也显示移植剂量达到108以上可明显改善严重心梗的预后。

4　临床研究效果

MSCs在动物模型被证明有良好的疗效后，大量的临床研究也在进行。其中包括大型的随机、双盲对照试验TAC - HFT［22］和POSEIDON［23］。TAC -HFT试验［22］是通过心内膜下注射细胞，比较自体MSCs（n=19）和单个核细胞（n = 19）对缺血性心脏病的疗效。与对照组相比，MSCs治疗组1年时严重不良事件发生率明显降低，6 min步行时间延长，明尼苏达心力衰竭评分显著改善，梗死面积占左心室百分比显著减小，但左心室容积和LVEF并未改善。POSEIDON试验［23］利用多排螺旋CT等技术比较自体MSCs和异体MSCs移植治疗缺血性心脏病的效果。研究表明，治疗组瘢痕面积减少了近40%；而未接受治疗的患者减少了25%，并且MSCs治疗的心脏节段对应的LVEF增加了近40%，未接受治疗的节段并没有明显改善。该试验不仅说明了移植MSCs部位的重要意义，而且证明了异体MSCs安全可行，有良好的治疗效果。

PROMETHUS试验［24］检测了6例行冠状动脉旁路移植术患者MSCs的治疗效果。该实验利用心脏MRI分析出与对照组相比，其LVEF增加，瘢痕面积减小，心脏收缩能力得到改善，证明了MSCs直接注入无血管区域的治疗潜能。C-CURE试验［25］共收入45例缺血性心力衰竭患者，其中24例接受规范药物治疗，21例接受经预处理的MSCs治疗。随访6个月时发现，心源性MSCs移植未诱发任何心律失常和不良事件；MSCs组患者6 min步行试验的临床表现显著改善，左心室舒张末容积和收缩末容积均有所下降，LVEF增加约5%，表明受预处理的MSCs可能有更好的血管再生能力。

TOPCARE-AMI试验［26］的结果也显示在治疗后第4个月，LVEF增加至8.5%，而对照组只增加2.5%。而且在5年的随访中LVEF、收缩末期容积及舒张末期容积均有明显改善。但相反，在BOOST试验［27］中，虽然经皮冠状动脉介入治疗时注入MSCs，6个月后对照组和移植组LVEF分别增加了0.7%和6.7%；但是5年的随访结果表明治疗效果并没有持续。

Janssens等［20］通过自体MSCs移植后发现，其并不增加MI后左心室整体功能恢复，但可显著减少梗死面积。ASTAMI和BONAMI试验则表明MSCs的治疗并没有明显效果［28-29］。这些不同的研究结果表明患者的个体差异、不同的细胞培养方式、移植方式的采取及设置的观测数据基准线不同等因素可能都会影响到研究结果。

总体来说，应用MSCs治疗的安全性和可行性在POSEIDON，C-CURE等试验中都已得到证实。Lalu等［30］检索了1950年至2011年采用MSCs治疗的文献，证明MSCs治疗是安全的。一项Meta分析了16项大型随机对照试验表明MSCs可以不同程度减少梗死面积，LVEF平均增加11.3%［31］。Jee⁃vanantham等研究表明接受MSCs治疗后心脏功能可以得到改善，而且心肌梗死的复发率和死亡率均有所下降［32］。

致谢：本文是在侯慧媛讲师、刘金成副教授指导下完成的，在此一并致谢。

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DOI：10.13498/ j.cnki.chin.j.ecc.2016.02.16

基金项目：国家自然科学基金（81570230，81570231，81570232，81570330）

通讯作者：刘金成，liujch69＠sina.com

收稿日期：（2016⁃03⁃23）

修订日期：（2016⁃04⁃10）