PAK5和MDRl/P-gp在卵巢癌细胞紫杉醇耐药中的表达和临床意义

邹竞慧　李笛悠　张　萍★

PAK5和MDRl/P-gp在卵巢癌细胞紫杉醇耐药中的表达和临床意义

邹竞慧李笛悠张萍★

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其病死率居女性生殖系统肿瘤首位，由于大多数卵巢癌发病隐匿，且缺乏准确有效的早期诊断方法。目前手术联合化疗的综合治疗在一定程度上延长了晚期卵巢癌患者的生存时间，但多数患者在18～24个月后复发，其5年生存率＜30%。肿瘤细胞减灭术加以铂类和紫杉醇为基础的联合化疗已成为当前卵巢癌的标准治疗手段。虽然多数患者初始反应敏感，甚至可达到近期缓解，但是由于化疗耐药的产生，限制了化疗药物的抗肿瘤效应，严重影响了卵巢癌患者的远期疗效和总体生存率。以往针对耐药机制进行了一些耐药逆转的研究。但是大多数研究结果均未显示上述方法的有效性。因此，深入探索与化疗耐药相关的细胞及分子生物学机制，寻找有效干预靶点，成为改善化疗效果和解决耐药问题的关键。

1　卵巢癌细胞耐药机制

紫杉醇是卵巢癌的一线化疗药物，关于卵巢癌耐药机制，传统假说认为，肿瘤细胞在长期进化过程中发生获得性体细胞突变或表基因改变导致耐药［1］。目前更多的研究认为卵巢癌肿瘤细胞特异性耐药机制主要是：（1）细胞内有效药物浓度降低。多药耐药蛋白（MRP）、膜转运蛋白P糖蛋白（P-gp）、肺耐药蛋白（LRP）等通过药物泵进、泵出平衡的改变导致细胞内有效药物浓度降低，诱发卵巢癌细胞耐药［1］。最近，Penson等［2］发现P-gp表达与卵巢癌复发患者对紫杉醇的再次化疗的缓解率呈负相关。Koji Matsuo等［3］实验证明MDR-1与卵巢癌晚期脑转移高度相关，具体机制目前尚不清楚。H Chen等［4］发现MDR-1与uPA、CD44在ECO耐药细胞中共表达，并且随着ECO恶性程度增强，表达量增加。另外，谷胱甘肽s转移酶（GST）使细胞内游离药物与谷胱甘肽结合而失活也诱导耐药，但卵巢癌患者GST表达与化疗缓解率及预后的关系目前尚未明确。该系统可促进体内有毒物质的排出，防止有毒化合物与DNA、RNA和蛋白质等生物大分子物质的结合，其中研究较多的是谷胱甘肽s转移酶（GST），GST水平升高与紫杉醇MDR有关。（2）DNA的损伤修复异常。Gifford等［5］发现卵巢癌复发的患者血浆中DNA-MLHl甲基化的比率明显升高，这与其血浆DNA微卫星不稳定性相关，导致DNA的损伤修复异常。还有研究表明乳腺癌易感基因（BRCAl）也在DNA损伤修复过程中发挥重要作用，目前认为其功能缺失可能降低纺锤体抑制剂的作用，增加了细胞对DNA损伤性化疗药的敏感性［6］。（3）药物作用靶点改变。研究发现紫杉醇介导微管蛋白聚合的β微管蛋白基因突变，微管蛋白亚型改变表达和微管蛋白浓度降低，破坏了细胞有丝分裂期和分裂间期功能所必需的微管系统动态再生，可能导致紫杉醇耐药。具体机制目前尚不清楚［1］。（4）药物靶分子下游效应信号传导通路异常。由于多数肿瘤对不同药物及放疗均存在交叉耐药性，近年来研究的重点已从药物特异性机制转移到药物靶分子的下游效应途径及共同的凋亡信号。一些癌基因、抑癌基因及凋亡调控分子参与这些效应途径。近来研究发现紫杉醇可靶激活巨噬细胞，导致肿瘤坏死因子（TNF-a）受体的减少及TNF-a释放，作用于细胞凋亡受体途径的Fas/Fas-L通路，或激活天冬氨酸蛋白酶家族（caspases）抑制细胞凋亡，诱发耐药［7］。体外研究还发现，抗凋亡蛋白Bcl-2、IAP、热休克蛋白（HSPT0、rISP90）等表达上调，凋亡前蛋白BAX表达下调降低了卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性，一些临床研究也支持Bcl-2和IAP参与耐药，因此Bcl-2高表达可能是卵巢癌患者预后良好的标志，目前已有利用Bcl-2反义核酸作为化疗增敏剂的临床研究［8］。（5）影响细胞膜形态及功能。紫杉醇可以通过影响细胞骨架中的肌球蛋白和微管形成，促进细胞骨架重排，抑制细胞胞膜伪足形成，从而影响肿瘤细胞的趋化作用及远处迁移［9，10］。（6）其他如肿瘤微环境的改变［11］。肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系。肿瘤微环境不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且亦与肿瘤细胞自身的（核和胞质）内在环境有关。肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。全身和局部组织亦可通过代谢、分泌、免疫、结构和功能的改变，限制和影响肿瘤的发生和发展。一般认为与肿瘤组织内新生血管结构和功能严重缺陷造成组织内间隙液体压升高、低氧环境和酸中毒等因素有关，这种异常的微环境形成的机制目前尚未完全阐明。某些肿瘤细胞系对紫杉醇的敏感性还依赖于纺锤体检查点的功能状态，在临床耐药中的作用仍需进一步研究［12］。

2　肿瘤多药耐药MDRl及其所编码的P-gp机制

目前卵巢癌紫杉醇耐药机制中，研究最多最重要的是肿瘤细胞对紫杉醇产生多药耐药（Multidrug resistance，MDR）。MDR指肿瘤细胞对结构和作用机制不相同的药物均产生耐药的现象，与多药耐药基因MDRl及（或）多药耐药相关蛋白（MRP）基因过度表达有关。人类MDR基因家族是由MDR1基因和MDR3基因组成，并编码各自的P糖蛋白（P-gp），其中MDRl及其所编码的细胞膜P糖蛋白（P-gp）表达增加介导的卵巢癌介导的紫杉醇耐药中最为常见。 P-gp为三磷酸腺苷（ATP）结合转运蛋白（ATP binding cassette，ABC）家族成员之一，具有ATP酶活性，是一种分子量约为170KD跨膜运输蛋白，由1280个氨基酸残基组成，嵌插在细胞的浆膜上形成通道，细胞内包括疏水性化疗药物在内的中性或带正电荷的疏水性分子可以通过该通道将相同的天然药物如紫杉醇、环孢菌素等药物排出细胞外，降低细胞内的有效药物浓度，从而阻碍化疗药物作用的发挥而产生耐药［13］。肿瘤药诱导细胞MDR1表达可能是导致卵巢癌治疗失败的主要原因［14］。最近还有研究表明肿瘤MDR形成造成肿瘤的化疗不敏感，可能引起肿瘤的侵袭性和转移性改变，但具体机制尚未阐述［15］。

Gottesman等［16］在早期的研究中证明P-gp是由PKC磷酸化的，磷酸化后的P-gp具有跨膜转运功能，并且这种磷酸化过程可被verapamiI 抑制，而被PKC激活剂增强。PKC是一种普遍存在的磷脂依赖性酶，与细胞增殖分化，凋亡的信号转导密切相关，同时参与了MDR形成过程的调控［17］。

3　PAK5在卵巢癌细胞紫杉醇耐药中的表达和功能

3.1PAK5的特点和生理功能 PAK5为p21活化的激酶（PAKs）家族中新近发现的成员，PAKs是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过与Rac和Cdc42结合而激活发挥作用。作为小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白，PAK5可被生长因子及其他胞外信号活化。近来研究表明PAK5在神经源性肿瘤、胃肠癌、骨肉瘤、乳腺癌及卵巢上皮癌等组织细胞中过度表达。PAK5是多种信号传导通路的核心分子，当PAK5激活后，活化下游的效应蛋白，如MAPK、JNK等引起生物学功能的改变，如细胞的异常增殖，细胞的粘附迁移和细胞抗凋亡等［18］。Cotteret等［19］发现PAK5定位于细胞线粒体时，通过直接磷酸化BAD蛋白第112位丝氨酸（Bad Serl12）抑制细胞凋亡，当PAK5定位于细胞核时，不能有效的磷酸化BAD，不能抑制细胞凋亡。另外，PAK5也能通过AKT途径间接磷酸化BAD蛋白第136位丝氨酸（Bad Serl36），抑制细胞凋亡［20］。

3.2PAK5在肿瘤组织中的表达和功能 近来研究表明，在脑胶质瘤中，PAK5可与细胞骨架中的肌球蛋白和微管结合，促进微管形成，影响细胞运动［21］。PAK5还可与细胞外基质受体结合，激活整合素，促进粘附结构蛋白及小GTPaseRac、Cdc42在细胞膜上簇集粘附，促进细胞骨架重排，增强细胞极性化，刺激细胞胞膜形成丝状伪足及片状伪足［22］。Wang等［23］发现PAK5通过直接磷酸化Bad Ser112位点和通过AKT间接磷酸化Bad Serl36，显著降低Bad与Bcl-2或Bcl-x（L）的相互作用，增加Bad与14-3-3蛋白的相互作用，抑制结肠癌细胞凋亡。而Gu等［24］发现PAK5通过CDK2， CDC25A和细胞周期D1阻滞细G（0）/G（1）期，抑制胃癌细胞增殖。在骨肉瘤组织中，PAK5通过磷酸化P-BAD激活Caspase-3，Caspase-9抑制细胞凋亡［25］。Taneja等［26］证明PAK5是乳腺癌细胞凋亡抑制因子，抑制PAK5基因表达可上调p21蛋白的表达，下调CyclinD1蛋白，使细胞停滞在Gl期，抑制细胞增殖，同时下调凋亡相关蛋白pre-caspase8及pre-caspase3的表达，诱发细胞的凋亡。最新研究在乳腺癌细胞中，发现PAK5通过磷酸化GATA1 Ser161和Ser187抑制细胞间质钙粘蛋白，细胞连接断裂，促进上皮间质转化，降低细胞间的粘附性，使乳腺癌细胞侵袭转移明显增强［27］。

3.3PAK5在卵巢癌细胞紫杉醇耐药的表达和功能 Diyou等［28］证明PAK5在卵巢癌细胞中的过表达，且随着卵巢癌恶性程度增加，PAK5表达量增高，同时PAK5促使卵巢癌发生紫杉醇耐药。PAK5基因还可以调节卵巢癌细胞周期促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱发卵巢癌耐药。PAK5基因可能通过作用于细胞骨架中的肌球蛋白和微管结合，影响细胞膜的运动形态及功能，改变了细胞的抗药性。关于PAK5诱发卵巢癌细胞耐药的具体机制及下游的信号传导通路目前尚不清楚。

4　展望

综上所述，在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中，P-gp和PAK5均高度表达，众多证据表明卵巢癌耐药机制中，多药耐药基因MDRl及其所编码的细胞膜P糖蛋白（P-gp）表达增加介导的卵巢癌紫杉醇耐药最为重要，同时发现PAK5可以通过各种信号传导通路在恶性肿瘤组织细胞中发挥作用，如细胞的异常增殖，细胞的粘附迁移和细胞抗凋亡等。最新研究确定PAK5是卵巢癌紫杉醇耐药的核心调节靶点之一，接下来进一步研究PAK5基因的分子生物学作用机制，PAK5是否通过介导MDRl/P-gp的表达参与卵巢癌细胞紫杉醇耐药，这为临床上干预有效的信号传导环节及研发新型的肿瘤抑制性药物提供新的思路。

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上海市卫生局课题项目（20144Y0144）

联系单位：200092 上海交通大学医学院附属新华医院妇科