寄生性杂草列当的种类调查及鉴定

王亚娇， 纪莉景， 栗秋生， 王连生， 潘进红， 孔令晓

(1.河北省农林科学院植物保护研究所/河北省有害生物综合防治工程技术研究中心/农业部华北北部作物

有害生物综合治理重点实验室，河北保定 071000； 2.河北省张家口蔚县农牧局，河北张家口 075000)



寄生性杂草列当的种类调查及鉴定

王亚娇1， 纪莉景1， 栗秋生1， 王连生1， 潘进红2， 孔令晓1

(1.河北省农林科学院植物保护研究所/河北省有害生物综合防治工程技术研究中心/农业部华北北部作物

有害生物综合治理重点实验室，河北保定 071000； 2.河北省张家口蔚县农牧局，河北张家口 075000)

摘要：列当是一类难以防治的恶性根寄生杂草，目前在番茄、向日葵、烟草和瓜类上危害日益严重。列当的种类多且难以区分，明确列当的种类对制定有效防治措施具有重要意义。从新疆维吾尔自治区、河北省、内蒙古自治区和吉林省4个地区采集了19份列当样品，通过形态观察和DNA条形码技术进行种类鉴定并对其亲缘关系进行讨论。结果发现，寄生于新疆番茄上的列当样品为分枝列当，寄生于河北烟草、河北向日葵和吉林向日葵上的列当样品为弯管列当；在系统发育树中分枝列当与弯管列当有明显的系统进化差异性，弯管列当被分为2个大类群，地理区划明显而与寄主植物无关，采集自河北省的7个样品为1个类群，采自吉林省、新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区的8个样品为第2个类群，其中第2类群中采自吉林省的4个样品亲缘关系最近。

关键词：寄生性杂草；列当；形态鉴定；DNA条形码；系统进化

列当属(Orobanche)隶属列当科(Orobanchaceae)，是一类恶性寄生杂草[1-2]，由于没有叶绿素，其生长所需的水分和养分需要用吸盘从寄主根部吸收[3]。寄主被寄生后，植株生长缓慢，矮化、黄化萎蔫或枯死，造成农作物产量降低和品质下降，严重时可导致农作物绝收[4]。列当属在全世界约有100多种，主要分布于地中海沿岸、亚洲西部地区、东欧、中美洲南部及大洋洲、非洲东部和北部等地区[5-6]。列当于1963年在我国新疆首次被报道出现[7]，到目前为止，我国报道的列当约有23种，主要分布在新疆、甘肃、河北、山东、山西、辽宁、内蒙古等十几个省(区)[8]。列当寄主范围广泛，可寄生在菊科、豆科、茄科、葫芦科、十字花科、大麻科、亚麻科、伞形科、禾本科等植物根上[9]。

列当的种类繁多，一种寄主可以被寄生不同种类的列当，同种列当又可以寄生不同种类的植物，并且当同种列当寄生于不同的寄主上时，它们的形态和生活史具有差异性，极易被人们认定为2种不同的列当，因此明确寄主上寄生列当的种类能够使防治工作更有针对性和高效性。传统的列当鉴定方法为形态学鉴定，这种方法的准确性和效率极大地依赖于分类学家的经验，因此不可避免地会遇到人为的错误以及其他无法克服的困难。DNA条形码技术是通过对1段标准化基因序列进行分析来实现对生物物种准确快速鉴定的技术[10]。自2003年提出以来，DNA条形码技术被广泛地应用于生物分类学研究。高等植物的核rRNA中的18S、5.8S、26S为1个转录单位，位于18S与5.8S、5.8S与26S基因之间的间隔区被称为内部转录间隔区(internally transcribed spacer，ITS)[11]，该区域具有较高的保守性，被广泛地用于植物和真菌种类鉴定。刘珉璐等基于ITS基因的DNA条形码技术进行了马先蒿属植物种类的快速鉴定[12]。ITS基因被应用于列当科的分类鉴定和遗传进化分析中，2003年Schneeweiss等通过ITS构建了列当属的系统进化树[13]。国内尚无有关列当种类分子鉴定的报道，本研究从新疆维吾尔自治区、河北省、内蒙古自治区和吉林省4个地区采集了19份列当样品，通过形态学鉴定和基于ITS基因的DNA条形码技术对列当样品进行了种类鉴定和遗传进化分析，旨在为今后列当的分布危害情况调查及开展防治工作提供科学依据。

1材料与方法

1.1列当采集来源

2005—2014年在河北省、新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区和吉林省4个地区采集19份列当植株样品，样品采集信息见表1。

表1　供试列当植株信息

1.2试验试剂

主要试验试剂：DNA提取试剂盒Nuclean platGen DNA Kit(北京康为世纪生物科技有限公司)，PCR所用试剂：2×TaqPCR Master Mix、DL 2000 DNA(北京天根生化科技公司)，TS特异性引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3试验方法

1.3.1列当的形态观察从不同的寄主植物上采集典型的列当植株，解剖观察列当植株的形态特征，在显微镜下观察列当种子的特征，并拍照进行描述，根据《中国植物志》鉴定到种。

1.3.2ITS基因扩增与测序根据DNA提取试剂盒Nuclear PlantGen DNA Kit说明书分别提取列当样品种子的基因组DNA。利用ITS特异性引物(F：5′-AAAGCAGACCGTGAACATGT-3′； R：5′-CGCCTATTACCGGAGGGCAC-3′)扩增ITS目的基因。PCR的反应体系为50 μL，其中模板DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，PCR Master Mix 25 μL，无菌水 19 μL。扩增反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR的产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序部测序。

1.3.3序列比对和分析利用NCBI的BLAST程序进行序列同源性分析；通过MEGA 5.0软件构建UPGMA树(unweighted pair-group method with arithmetic means)分析进化关系。

2结果与分析

2.1形态描述

采集自新疆库尔勒的寄生于番茄上的1—4号列当形态(图1)为：一年生寄生草本，高15～50 cm，全株被腺毛，褐色或浅黄色；不含叶绿素，无真根，有短须状吸盘；茎自基部或中部分枝具条纹；叶片为鳞片或瓦状披针形，小而无柄，螺旋状排列在茎秆上；穗状花序，长8～15 cm，花的基部生有1张苞片，卵状披针形；小苞片2枚，线形，与苞片近等长；下部花有 1～2 μm 长的短梗，向上梗逐渐变短直至无梗；花萼短钟状，4裂达近中部，披针形；花冠为蓝紫色，近直立，长2.0～3.5 cm，向上逐渐膨大，筒部漏斗状，在花丝着生处缢缩；花冠合瓣，呈二唇形，上唇为2裂，下唇为3裂，下唇长于上唇，所有裂片均被长柔毛；4枚雄蕊，2长2短，花丝基部疏被短柔毛，向上逐渐变为无毛，花药为卵形，沿缝线密疏被白色长柔毛；1枚雌蕊，子房为椭圆形，上位，1室，侧膜胎座4个，胚珠倒生，柱头膨大且具2浅裂，裂片半圆形；种子为卵圆形，长0.4～0.6 μm，直径约 0.25 μm，种皮具网状纹饰，网眼底部具网状纹饰。 通过观察发现与《中国植物志》报道的分枝列当形态特征值一致，初步鉴定为分枝列当。

采集自河北省、新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区和吉林省的5—19号列当形态(图2)相同：均为一年生寄生草本，高15～35 cm，全株密被白色腺毛；茎为黄褐色，无分枝；叶片为卵形或卵状披针形，螺旋排列在茎秆上；穗状花序，长5～20 cm；花的基部有1张苞片，苞片为卵形或卵状披针形；花萼为钟状，2深裂至基部，或前面分裂至基部后面分裂仅至中下部，裂片顶有2浅裂，小裂片线形，后面2枚裂片较长，前面2枚较短；花冠长1.0～2.2 cm，向上缢缩，口部稍膨大，在缢缩处稍扭转向下弯曲；花冠呈二唇形，上唇2浅裂，下唇稍短于上唇为3裂，裂片近圆形，边缘为不规则浅波状或小圆齿；4枚雄蕊，2长2短，花丝基部稍增粗且无毛，花药卵形，常无毛；1枚雌蕊，子房卵状长圆形，花柱稍粗壮，无毛，柱头2浅裂；蒴果为长圆形或椭圆形，干后呈深褐色；种子为长椭圆形，长0.4～0.5 μm，直径 0.18 μm，表面具网状纹饰，网眼底部具蜂巢状凹点。通过观察发现与《中国植物志》报道的弯管列当的形态特征一致，初步鉴定为弯管列当。

2.2分子鉴定结果

提取19个列当样品种子的DNA，用ITS特异性引物进行PCR扩增，获得约为400 bp大小的条带(图3)，经测序比对后发现1—4号列当种子的DNA与GenBank中KC811199.1分枝列当的相似度为97%～100%，5—19号列当种子的DNA与GenBank中AY209230.1弯管列当的相似度为97%～100%。分子鉴定的结果与形态学鉴定结果相同，认为寄生于番茄的1—4号列当为分枝列当，寄生于向日葵和烟草的5—19号列当为弯管列当。

2.3系统进化分析

从NCBI中下载弯管列当ITS序列KC811199.1和分枝列当的ITS序列AY209230.1，将其与本试验中测序的19个列当样品的ITS基因序列通过MAGE5建立UPGMA树(图4)并计算遗传距离，结果发现新疆库尔勒番茄上寄生的列当XKF-1、XKF-2、XKF-3和XKF-4与NCBI中下载的分枝列当的ITS序列AY209230.1聚为1个类群，而剩余的15个列当样品与NCBI中下载的弯管列当ITS序列KC811199.1聚为1个类群，说明该结果与形态和分子鉴定的结果相同，寄生于番茄的列当XKF-1、XKF-2、XKF-3和XKF-4为分枝列当，剩余的15个列当样品为弯管列当。

分枝列当与弯管列当有明显的系统进化差异性。弯管列当的种內差异性较小，弯管列当被分为2个大类群，遗传距离在0.002～0.043之间，采集自河北的7个样品为1个类群，采自吉林、新疆和内蒙古的8个样品与NCBI中下载的采集自新疆的弯管列当KC811199.1为第2个类群，其中第2群中采自吉林的4个样品亲缘关系最近。与弯管列当相比，分枝列当的种间差异较大，为0.033～0.083。

3结论与讨论

本研究通过形态学和DNA条形码技术鉴定了国内4个省19个列当样品的种类。新疆库尔勒番茄上寄生的列当均为分枝列当，寄生烟草和向日葵的均为弯管列当，与形态学鉴定结果相同，证明了ITS基因可以用于列当的种类鉴定，从而实现了列当物种快速准确的鉴定。

从构建的UPGMA树可以看出，分枝列当和弯管列当之间具有明显的种间差异性。与分枝列当相比，弯管列当的种內差异性较小。15个弯管列当样品中采集自河北的7个样品为1个类群，采自吉林、新疆和内蒙古的8个样品与NCBI中下载的采集自新疆的弯管列当KC811199.1为第2个类群，其中第2类群中采自吉林的4个样品亲缘关系最近。说明弯管列当的种內遗传差异性与区域相关，而采集自河北的7株样品中，寄主为烟草的HXY和HGY与寄主为向日葵的HXX、HYX、HSX、HHX和HCX没有明显的遗传规律，说明弯管列当的种內遗传差异性与区域相关与寄主种类无关。

列当为恶性寄生杂草，难以防治，许多国家将其列为检疫对象[14-16]，我国将其列为进境植物检疫对象和内检对象，并已列入我国农业部颁布的《危险性病、虫、杂草名录》[17]。为防止列当随作物种子入侵和传播，常需要对作物种子样品进行检测和鉴定，目前常用的方法为显微镜检验[18]，费时费工，且漏检率高，而本研究中的DNA条形码技术可以替代常规的检疫方法，这将大大降低实际工作中的检疫难度，对进一步开展植物检疫工作的积极作用。为了评估列当发生区域寄主作物种植的安全性，需要对土壤中的列当种子、种类进行检测，避免在已受列当侵染的大田中种植可能的寄主作物，利用分子检测技术对指导列当防治也具有重要意义。

参考文献：

[1]Evidente A，Abouzeid A M，Andolfi A，et al. Recent achievements in the bio-control ofOrobancheinfesting important crops in the Mediterranean Basin[J]. J Agric Sci Technol A，2011，1：461-483.

[2]Parker C. Observations on the current status ofOrobancheandStrigaproblems worldwide[J]. Pest Management Science，2009，65(5)：453-459.

[3]Aly R. Conventional and biotechnological approaches for control of parasitic weeds[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2007，43(4)：304-317.

[4]Amri M，Abbes Z，Youssef S B，et al. Detection of the parasitic plant，Orobanchecumanaon sunflower (HelianthusannuusL.) in Tunisia[J]. Afr J Biotech，2012，11(18)：4163-4167.

[5]Joel D M，Chaudhuri S K，Plakhine D，et al. Dehydrocostus lactone is exuded from sunflower roots and stimulates germination of the root parasiteOrobanchecumana[J]. Phytochemistry，2011，72(7)：624-634.

[6]吴海荣，强胜. 检疫杂草列当(OrobancheL.)[J]. 杂草科学，2006(2)：58-60.

[7]张镇中. “瓜丁”是什么？ 怎样防治[J]. 新疆农业科学，1963(3)：7.

[8]张金兰，蒋青. 菟丝子属和列当属杂草重要种的寄主和分布[J]. 植物检疫，1994，8(2)：69-73.

[9]宋文坚，曹栋栋，金宗来，等. 我国主要根寄生杂草列当的寄主、危害及防治对策[J]. 植物检疫，2005，19(4)：230-232.

[10]Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society of London，2003，270(1512)：313-321.

[11]China Plant BOL Group，Li D Z，Gao L M，et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(49)：19641-19646.

[12]刘珉璐，郁文彬，王红. 植物物种的快速鉴定与iFlora：DNA条形码在马先蒿属中的应用[J]. 植物分类与资源学报，2013，35(6)：707-714.

[13]Schneeweiss G M，Colwell A，Park J M，et al. Phylogeny of holoparasiticOrobanche(Orobanchaceae) inferred from nuclear ITS sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2004，30(2)：465-478.

[14]唐嘉成，兰艳丰，夏博，等. 施用有机肥对防治烟草上向日葵列当的效果[J]. 江苏农业科学，2013，41(4)：119-121.

[15]黄建中，李扬汉. 检疫性寄生杂草列当及其防除与检疫[J]. 杂草科学，1994(4)：7-9.

[16]曲正义，金银萍，侯微，等. 紫外分光光度法测定向日葵列当中苯乙醇总苷的含量[J]. 江苏农业科学，2014，42(9)：282-284.

[17]刘长江 .列当属、野菰及独脚金种子的扫描电镜观察[J]. 植物检疫，1994，8(6)：335-337.

[18]李春. 用荧光显微镜检测和鉴定列当属种子[J]. 植物检疫，1989，3(4)：261.

李儒海，褚世海，魏守辉，等. 不同施肥量对稻茬冬小麦田当季杂草群落的影响[J]. 杂草科学，2015，33(3)：11-15.

王亚娇，纪莉景，栗秋生，等. 寄生性杂草列当的种类调查及鉴定[J]. 杂草科学，2015，33(3)：6-10.

Survey and Species Identification of Parasitic Weed Broomrape

WANG Ya-jiao1， JI Li-jing1， LI Qiu-sheng1， WANG Lian-sheng1， PAN Jin-hong2， KONG Ling-xiao1

(1.Institute of Plant Protection，Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Technology Research Center of

Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China，Ministry of

Agriculture，Baoding 071000，China； 2.Agriculture and Animal Husbandry Bureau in Yu County of Zhangjiakou

City in Hebei Province，Zhangjiakou 075000，China)

Abstract:As noxious root parasitic weeds，species of Orobanche (broomrape) are hard to control and cause serious losses in many subtropical crops such as tomato，sunflower，tobacco and melon. It is difficult to distinguish the numerous broomrapes yet it is of great importance to correctly identify them to design effective control measures. Nineteen types of broomrapes were collected from Xinjiang Uyghur Autonomous Region，Hebei Province，Inner Mongolia Autonomous Region and Jilin Province. Species were identified by morphologic observation and DNA bar code technology，and their genetic relationships were investigated. Broomrape parasitizing tomato in Xinjiang was Orobanche aegyptiaca Pers.；those parasitizing tobacco and sunflower in Hebei Province and sunflower in Jilin Province corresponded to Orobanche cernua Loefling. There are obvious system evolutionary differences between O. aegyptiaca and O. cernua in the phylogenetic tree. O. cernua was divided into two taxonomical groups with obvious geographical zoning differentiation unrelated to the host plant. Seven types of broomrapes collected from Hebei Province belonged to a group，eight types from Jilin Province，Xinjiang

Uyghur Autonomous Region and inner Mongolia autonomous region belonged to the second group. In the second group，four broomrapes collected from Jilin Province have the closest genetic relationship.

Key words:parasitic weed；broomrape；morphological character identification；DNA bar code；phylogeny

通信作者：孔令晓，硕士，研究员，研究方向为植物病害。E-mail：konglingxiao163@163.com。

作者简介：王亚娇(1988—)，女，河北保定人，硕士，研究实习员，主要从事植物病害和列当综合防治研究。E-mail：yajiaowang515@163.com。

基金项目：河北省财政项目(编号：F13R10001)；河北省财政基本科研业务费(编号：494-0401-JBN-6440)。

收稿日期：2015-04-13

中图分类号：S451

文献标志码：A

文章编号：1003-935X(2015)03-0006-05