制草乌水煮法炮制工艺质量研究

制草乌水煮法炮制工艺质量研究

傅素华1，韩 鹏2*，田利洪2，蒋桂池2，叶兴法2

(1. 绍兴市食品药品检验所，绍兴312000； 2. 浙江景岳堂药业有限公司，绍兴312025)

摘要：目的研究制草乌水煮法炮制工艺的最佳参数。方法 选择加水量、浸泡时间、水煮时间3个因素，以炮制前后乌头类双酯型总生物碱和乌头类单酯型总生物碱的含量为考察指标，优选炮制工艺参数。结果 最佳工艺参数为：加水量5倍，水煮时间2 h，浸泡时间8 d。结论 依据该工艺参数，经3批大生产样品验证，均符合《中国药典》2010年版一部制草乌项下有关规定，表明该工艺稳定可行，适用于规模化生产。

关键词：草乌；制草乌；炮制；总生物碱

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.008

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2015)03-0244-03

Abstract:ObjectiveTo investigate the optimal processing parameters of water-boiling method for prepared Kusnezoff monkshood root. MethodThe effects of three factors on the processing were investigated including the amount of water，the soaking time and the boiling time. The total aconitine-type diester-diterpenoid alkaloids and the total aconitine-type monoester alkaloids detected before and after processing were taken as indices. ResultsThe optimal processing parameters were as follows:the amount of water:5 folds, the boiling time:2 hours，the soaking time:8 days.ConclusionUnder the processing parameters， three production lots of prepared Kusnezoff monkshood root all met the requirements of Chinese Pharmacopoeia (in 2010 eaition).The optimized processing parameters is stable，feasible and suitable for large-scale production

作者简介：傅素华，男，主管中药师

收稿日期：(2014-11-04)

Study on the water-boiling process method of prepared Kusnezoff monkshood root

FU Suhua1，HAN Peng2*，TIAN Lihong2，JIANG Guichi2， YE Xingfa2(1.Shaoxing Institute for Food and Drug Control，Shaoxing 312000， China； 2.Zhejiang Jingyuetang Pharmaceutical Limited Company， Shaoxing 312025,China)

Key words:Kusnezoffmonkshoodroot； preparedKusnezoffmonkshoodroot； processing； total alkaloid

*通信作者：韩鹏，女，高级工程师

草乌为常用毒性中药，性辛、苦、热 有大毒，归心、肝、肾、脾经，功能主治为祛风除湿、温经止痛，用于风寒湿痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛。其主要成分为乌头类双酯型生物碱，包括乌头碱、新乌头碱和次乌头碱。现代药理学研究表明，该类生物碱具有镇痛、麻醉、抗炎、降压等作用，但毒性极强，成人口服0.2 mg即产生中毒反应，2~4 mg·kg-1可致人死亡[1]。一般多经炮制减毒后使用，草乌的炮制方法很多，有蒸法、清水煮法、豆腐煮法等炮制方法， 其中以清水煮法工艺最为简单、常用，且其“去毒”效果较好[2]，经炮制后乌头类双酯型生物碱大大减少，而水解后乌头类单酯型生物总碱，包括苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的量会增加，其毒性为原双酯类生物碱的1/2 000~1/4 000[3]。草乌及制草乌被历版《中国药典》及多个省市中药饮片炮制规范所收载，但《中国药典》2010年版显著提升了制草乌的质量控制标准[4]，其中草乌药材项下规定乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量总和应控制在0.10%~0.50%，炮制后其乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量总和控制不得超过0.040%，水解产物苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的总和控制在0.020%~0.070%，而按以往传统炮制经验参数加工，产品出现较多不合格情况，但药典标准制法中又缺乏具体的工艺参数，因此，希望通过实验研究掌握各参数变化规律，并为制草乌炮制工艺确定具体的参数值。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-15C高效液相色谱仪(岛津仪器(苏州)有限公司)； AE200电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；DL-480E超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)； DFT-200高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；DHG-9140A电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；药典标准三号筛。

1.2试药对照品：乌头碱(批号110720-200410)，新乌头碱(批号110799-200404 )，次乌头碱(批号110798-200404)，苯甲酰新乌头原碱(批号110795-201102)，苯甲酰次乌头原碱(批号111796-201102)，均由中国食品药品检定研究院提供；苯甲酰乌头原碱对照品(批号130513，由上海哈灵生物制品有限公司提供)；乙腈、四氢呋喃为色谱纯；水为超纯水；醋酸铵、冰醋酸、异丙醇、三氯甲烷、氨、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯均为分析纯。

草乌药材由浙江景岳堂药业有限公司提供，产地为四川，经鉴定，为毛莨科植物北乌头AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥块根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为Ultimate AQ-C18(水性，250 mm ×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-四氢呋喃(25∶15)为流动相A，以0.1 mol· L-1醋酸铵溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)为流动相B，按药典草乌含量测定项下规定的方法进行梯度洗脱；检测波长为235 nm。理论板数按新乌头碱峰计算应不低于2 000。

2.2 对照品溶液的制备 取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品，精密称定，加异丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液分别制成每1 mL含乌头碱30 μg、次乌头碱10 μg、新乌头碱50 μg、苯甲酰乌头原碱20 μg、苯甲酰次乌头原碱0.1 mg、苯甲酰新乌头原碱80 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备取本品粉末(过3号筛)约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，称定质量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz；水温在25℃以下)30 min，放冷，再称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，在40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液3 mL溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.5 炮制方法 按《中国药典》2010年版规定草乌的炮制方法：取草乌，大小个分开，用水浸泡至内无干心，取出，加水煮至取大个切开内无白心、口尝微有麻舌感，取出，晾至六成干后切片，干燥。本实验中采用个头大小均匀的草乌，参考《浙江省中药炮制规范》2005年版[5]，切成1~2 mm后的薄片，晒干。

2.6 不同加水量的影响 固定浸泡时间8 d，水煮时间2 h，选择加水量分别为5，10，15 和20倍进行研究。实验结果表明，在上述固定浸泡时间和水煮时间情况下，加水量对炮制品生物碱含量变化的影响不大，乌头碱和新乌头碱均几乎水解完全，次乌头碱尚有极少量未水解，测定结果见表1。

表1 不同加水量的影响实验结果

Tab.1 Results of sample detection for different water amount

影响因素乌头碱/%次乌头碱/%新乌头碱/%总双酯型生物碱/%苯甲酰乌头原碱/%苯甲酰次乌头原碱/%苯甲酰新乌头原碱/%总单酯型生物碱/%原药材0.0320.0630.3680.463000.0240.0245倍水00.00900.0090.0070.0110.0330.05110倍水00.00500.0050.0040.0070.0350.04615倍水00.00600.0060.0030.0050.0320.04020倍水00.00600.0060.0030.0050.0360.044

2.7不同水煮时间的影响 固定浸泡时间为8 d，加水量为5倍，选择水煮时间分别为0.5，1，2和3 h进行研究。实验结果表明，在固定上述浸泡时间和加水量情况下，水煮时间对炮制品生物碱含量变化有一定的影响，其中乌头碱水解的速度最快，几乎完全水解，新乌头碱水解速度稍慢，经2 h方水解完全，次乌头碱水解速度最慢，经3 h仍有部分未水解。测定结果见表2。

表2 不同水煮时间的影响实验结果

Tab.2 Results of sample detection for different boiling time

影响因素乌头碱/%次乌头碱/%新乌头碱/%总双酯型生物碱/%苯甲酰乌头原碱/%苯甲酰次乌头原碱/%苯甲酰新乌头原碱/%总单酯型生物碱/%原药材0.0320.0630.3680.463000.0240.0240.5h00.0330.0240.0570.0050.0120.1270.1441h00.0250.0120.0370.0070.0150.0630.0852h00.0090.0060.0150.0020.0060.0410.0493h00.0030.0040.0070.0050.0080.0320.045

2.8 不同浸泡时间的影响 固定加水量为5倍，水煮时间为2 h，选择浸泡时间分别为4，6，8和10 d进行研究。实验结果表明：在固定上述水煮时间和加水量的情况下，浸泡时间对炮制品生物碱含量变化影响最大，其中浸泡时间为8和10 d 2种条件下，总单酯型生物碱总量在合格范围内(0.02%~0.07%)。测定结果见表3。

表3不同浸泡时间的影响实验结果

Tab.3 Results of sample detection for different soaking time

影响因素乌头碱/%次乌头碱/%新乌头碱/%总双酯型生物碱/%苯甲酰乌头原碱/%苯甲酰次乌头原碱/%苯甲酰新乌头原碱/%总单酯型生物碱/%原药材0.0320.0630.3680.463000.0240.0244d00.0370.0380.0750.0140.0220.2140.2506d00.0270.0150.0420.0060.0120.0860.1048d00.0060.0030.0090.0040.0060.0390.04910d00.0050.0060.0110.0070.0050.0350.047

2.9 结论 分别取草乌50 kg，按照拟定的炮制方法试制样品3批进行验证，结果表明，3批样品(批号20140201，20140202，20140203)的乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量总和分别为0.008%，0.007%和0.010%，含苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱及苯甲酰新乌头原碱的总量分别为0.048%，0.051%和0.048%(以上结果均按干燥品计算)，结果均符合药典有关规定，表明工艺参数可控，产品质量稳定。建议最佳工艺参数确定为：加水量5倍，水煮时间2 h，浸泡时间8 d。样品的含量测定色谱图见图1。

图1HPLC图

A.对照品；B.生草乌；C.制草乌；1.苯甲酰新乌头原碱；2.苯甲酰乌头原碱；3.苯甲酰次乌头原碱；4.新乌头碱；5.次乌头碱；6.乌头碱

Fig.1 HPLC chromatograms

A. reference substance；B.Kusnezoffmonkshoodmother-root sample；C. preparedKusnezoffmonkshoodroot sample；1.benzoylmesaconine；2.benzoylaconine；3.benzoylhypacoitine；4.mesaconitine；5.hypaconitine； 6. aconitine

3 讨论

草乌经炮制后，双酯型生物碱明显降低，单酯型生物碱明显增加，符合酯型生物碱的水解原理，但从研究数据中无法寻找到明显的线性变化规律。通过实验研究发现，浸泡时间是最重要的影响因素，加水量几乎没有影响。乌头类双酯型生物总碱水解比较完全，容易达到指标。该类成分虽然是毒性成分，但也具有药理活性，因此认为不是水解越完全越好，适当保留更为合理。

乌头类单酯型生物碱的产生和进一步降解是比较难掌控的，浸泡时间在6 d内，苯甲酰新乌头原碱多为超标，但延长浸泡时间、或延长煎煮时间，会使该类生物碱低于下限。同时，炮制品的干燥温度也是重要的影响因素，本研究中采用传统晒干操作，参考其他文献和实验，建议干燥温度不超过40 ℃。

经不同浸泡时间炮制的制草乌外观性状略有不同，浸泡时间越短，表面颜色越深，越接近黑色，但仍符合《中国药典》黑褐色的要求。

综合本研究数据中两类生物碱的含量变化规律，留待今后与其他炮制方法进一步进行研究比对。

HPLC法测定2种乌头药材中生物碱的含量可为内标法[6]和外标法，本文采用《中国药典》制草乌项下外标法同时测定6种生物碱。

参考文献：

[1]周远鹏，江京莉. 附子的研究-Ⅵ: 附子中乌头碱及其有关化合物的药理作用[J].中国药理与临床，1992，8(5)：45-49.

[2]邓广海，林华，龚又明.草乌及其炮制品中6种生物碱成分的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(7)：35-38.

[3]杜贵友，方文贤.有毒中药现代研究与合理应用[M] .北京：人民卫生出版社，2003：561.

[4]国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010:220-221.

[5]浙江省卫生厅.浙江省中药炮制规范[S]. 杭州：浙江科学技术出版社，2005:73.

[6]柳文媛，刘静涵.HPLC法测定两种乌头药材中生物碱的含量[J].西北药学杂志，1998，13(1): 8-9.