烟草种子的老化规律研究

禹晓梅，马文广，2，郑昀晔，2

（1．玉溪中烟种子有限责任公司， 云南 玉溪653100；2．云南省烟草农业科学研究院， 云南 玉溪653100）

种子是农业生产中最重要的生产资料，种子质量的好坏直接影响到播种品质。种子质量是种子潜力的综合表现，种子具有优良品质是保证快速发芽、出苗整齐和健壮的先决条件［1］。种子活力是种子质量最重要的指标，它是指种子在发芽和出苗期间的活性强度及特性的综合表现。高活力种子发芽早、出苗整齐迅速，抵抗不良环境的能力强，具有明显的生长优势和生产潜力；低活力种子在适宜的条件下虽然能发芽，但是发芽缓慢，在不良环境条件下出苗不整齐，甚至不出苗。种子从形成发育直到成熟脱离母株，每时每刻都受到外界环境条件的影响。当种子达到生理成熟干重增至最大时，种子具有最高的活力，此后随着种子不停的衰老向着死亡推移，活力逐渐下降，即发生种子老化（seed aging）。Gove［2］将种子老化定义为：种子的品质及其性能或生活力从较高水平下降至较低的水平。

烟草种质主要以种子的形式进行低温低湿保存，低温保存会延长储存寿命，但不能阻止老化［3－4］。种子老化劣变直接影响到种子的活力，从而对种子田间的出苗能力造成极其严重的影响，最终导致减产，给农业生产带来巨大的经济损失。种子老化也会引起遗传完整性的改变，老化到一定程度需要繁殖更新。

种子老化导致种子活力下降的机制非常复杂，其实质在于细胞结构与生理功能上发生的一系列变化［5－9］。人工加速老化和自然老化方法是研究种子老化过程中生理生化变化、种子活力变化及种子耐藏性等常用的两种方法。由于自然老化过程缓慢，所需的时间很长，难以获得试验材料等因素，所以在科学研究中一般很少采用这种方法。而人工加速老化能够克服自然老化所需时间长的不足，容易在较短的时间内获得不同活力的种子材料，因而广泛应用于种子老化机理的研究。大量研究表明，利用人工老化法使种子活力迅速丧失，只是加速了种子内部的代谢过程，并无老化机理上的差异。因此，人工老化法可以模拟种子的自然老化和劣变过程［10－13］。

本实验采用高温高湿加速老化方法，旨在研究不同老化温度和时间对烟草种子发芽率的影响以及种子老化过程中抗氧化酶的变化规律，为探讨烟草种子老化特性和机理提供理论参考依据。

1 实验材料

本实验选用烤烟品种云烟97为研究对象，进行人工老化实验。

2 实验方法

2．1 烟草种子吸湿等温曲线

将烟草种子放在分别含有不同溶度LiCl溶液的环境中，相对湿度为18%、33%、44%、60%、85%和100%的密闭瓶子中，放置于控温房中（20±1）℃使其平衡大概4周的时间，直到种子的水势稳定。种子含水量的计算是基于鲜重进行。种子的干重通过在烘箱中105℃，17h后获得，含水量按照公式（1）进行计算：

公式（1）：含水量（%）＝（鲜重－干重）／鲜重×100%。

2．2 人工加速老化测定温度和时间的设置

将种子分别置于39，41，43，45℃下，湿度为100%的环境中进行人工加速老化处理，并在每个温度环境下对供试种子分别老化24，36，48，60，72，84，96h，以未处理种子为对照。

2．3 种子活力测定

发芽试验按照国际种子检验规程（ISTA）规定条件进行，取两层滤纸平展在直径为9cm的玻璃培养皿中并充分吸水，将不同老化天数种子和对照分别均匀摆放在滤纸上，每皿100粒，放入光照培养箱中培养萌发，温度25℃，3次重复，各处理每日分别加入适量的蒸馏水以保证正常生长。5d测定种子发芽势，14d统计其发芽率和幼苗干重（幼苗在105℃烘箱中杀青15min，90℃烘干17h后称重为幼苗干重），萌发定义为子叶变绿。种子发芽指数和活力指数按下列公式（2），（3）计算：

公式（2）：发芽指数＝∑（Gt／Dt），式中Gt为t日的发芽数，Dt为相应的发芽日数。

公式（3）：种子活力指数＝发芽指数×幼苗干重（mg）。

2．4 种子浸提液相对电导率的测定

分别称取不同老化时间的种子材料，3次重复，用去离子水冲洗2遍，加入20mL去离子水，在20℃恒温条件下浸种3h，然后用DDS－11A型电导率仪测定煮沸前浸出液电导率，再煮沸10min，冷却至室温时测定煮沸电导率。

公式（4）：相对电导率（%）＝煮沸前浸出液电导率／煮沸电导率×100%。

2．5 丙二醛（MDA）含量的测定

称取0．2～0．5g种子中加入2mL 10%三氯乙酸（thichloroacetic acid，TCA）研磨提取2min；提取液转入离心管，用3mL 10%TCA分3次冲洗研钵（1mL／次），冲洗液与提取液合并；10 000×g离心15 min，取上清液，用10%的TCA 溶液定容至5mL；取1mL上清液，加入1mL 0．6%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），100℃水浴加热20min，迅速冷却；10 000×g离心10min，取上清液在532，600，450 nm测定吸光值（Abs）。

MDA含量计算：公式（5）：样品提取液中MDA的浓度（c）＝6．45×（A532－A600）－0．56×A450（试中：样品中MDA的质量摩尔浓度（μmol／L）＝C×N／W 。

C为 MDA 浓度（μmol／L），N 为提取液体积（L），W 为组织的干重（g）。

2．6 3种抗氧化酶（POD、SOD、CAT）的提取方法与测定

称取0．2g材料，加入预冷的提取液3mL，充分冰浴研磨，然后转入离心管，再用2mL提取液冲洗研钵，于4℃下20 000×g离心20min，分装上清液，于液氮冷冻后在－80℃超低温冰箱保存，待测。酶提取系统配方为50mmol／L Tris－HCl缓冲液，pH＝7．0，内含20%甘油，1mmol／L EDTA，1mmol／L AsA，1mmol／L DTT，1mmol／L GSH，5mmol／L MgCl2，配好后于4℃冰箱保存。

超氧化物歧化酶（SOD）的测定用氮蓝四唑（NBT）还原法测定，以OD560变化0．5为一个酶活单位（U）；过氧化物酶（POD）的测定参照愈创木酚法，以每分钟OD470变化0．01为一个酶活单位（U）；过氧化氢酶（CAT）的测定，以每分钟OD240变化0．1为一个酶活单位（U）。

2．7 统计分析

数据用SAS软件（8．0版）进行统计分析，多重比较采用LSD，α＝0．05，百分率数据在分析前进行反正弦转换（y＝arcsin［sqr（x／100）］）。

3 结果与分析

3．1 烟草种子吸湿等温曲线

种子寿命的外界因素主要有3个，即湿度（水分）、温度和空气含氧量，这3个因素中以水分最为重要。本试验研究了在不同空气相对湿度下烟草种子吸湿平衡含水率，得出了烟草种子的吸湿等温曲线（图1）。种子吸湿等温曲线与种子化学成分、组织结构及温度有关。烟草种子显示了典型的油料作物种子的吸湿等温曲线特征。空气湿度为18%时种子含水量为4%，空气湿度为33%种子含水量为5%，空气湿度为100%时种子含水量为25%。烟草种子含水量越低，种子储藏时间越长，一般烟草种子安全含水量为5%左右。烟草种子吸湿等温曲线可以为烟草种子在室内储藏以及包装袋内储藏的寿命研究提供理论依据。

图1 烟草种子的吸湿等温曲线

3．2 不同老化温度处理对烟草种子发芽率的影响

经过不同老化温度处理后测定结果显示（图2），烟草种子云烟97在各温度下随着老化时间的延长萌发率均下降，但是下降率不同。云烟97种子在30，35℃和38℃下老化96h后萌发率下降10%～20%左右，但是40℃老化72h后萌发率开始大幅下降，96h后萌发率显著下降至17%。因此，经过不同温度的老化处理均能够降低种子的发芽率，但是较低温度处理对萌发率高的种子老化效果不明显，而较高温度老化却可导致种子萌发率的迅速下降。因此，根据不同温度、不同时间对烟草种子老化情况，表明40℃和72h的老化处理组合可以将不同发芽能力的种子明显分开，是烟草种子人工加速老化处理的适宜条件。

图2 不同老化温度处理对烟草种子发芽率的影响

3．3 人工老化处理对烟草种子活力的影响

云烟97在40℃老化不同时间后的各项发芽指标见表1。经人工老化处理后，随老化时间的延长，烟草种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数均呈降低趋势。在老化进程中，除种子发芽率在老化24h时与对照差异不显著外，老化24h后，种子发芽势、发芽指数和活力指数显著下降，且以发芽势的降幅最大。如人工老化48h时，发芽势和活力指数则迅速下降，发芽势由对照99%下降到82%，变化率分别为17%；活力指数由对照20．55下降到13．57，变化率分别为33%；发芽指数由对照的9．48下降为6．47，变化率32%。随着老化时间的延长，种子的生理老化程度加深，表现为发芽速度减慢，种子的发芽率降低和种子的活力显著下降。

表1 人工老化过程中烟草种子活力的变化

3．4 人工老化过程中烟草种子抗氧化酶活性及膜质过氧化的变化

云烟97在40℃和100%RH相对湿度的环境中，经不同时间老化处理后，过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛含量和相对电导率的测定结果见表2。由表2可知，在种子老化过程中，云烟97种子中的过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性均随着老化时间的延长而呈下降趋势，并且在老化后期72h和96h下降较快。随着老化时间的延长，云烟97的相对电导率均呈上升趋势，在老化72h和96h时上升较快。膜质过氧化产物丙二醛（MDA）含量的变化趋势与相对电导率变化趋势一致，从24h至96h呈上升趋势，且上升幅度越来越大，特别是72h至96h时 MDA含量上升最快。表明烟草种子在人工老化过程中，随着POD、SOD、CAT等抗氧化物酶活性的降低，脂质和膜脂过氧化作用加强，造成MDA有害物质的累积及膜结构和功能受到破坏，透性增大，导致种子细胞内的矿物质和一些无机物质迅速外渗，电导率升高，并且随着种子老化程度加剧，这种趋势愈来愈明显。

表2 人工老化过程中烟草种子抗氧化酶活性及膜质过氧化的变化

4 总 结

试验以烟草种子云烟97为研究材料，人工加速老化的处理过程中，温度、时间对种子老化有重要的影响。表明40℃和72h的老化处理组合可以将不同发芽能力的种子明显分开，是烟草种子人工加速老化处理的适宜条件。

一般认为，衰老种子在死亡之前，其内部会发生一系列生理生化劣变，包括种子组成成分和酶活性的变化，有毒物质的积累，合成及修复能力的降低等，并且随着老化程度的加深，这些变化会越来越明显，最终导致种子不可逆转性死亡。种子内存在SOD、CAT、POD等抗氧化酶，其作为酶促抗氧化系统的重要组成部分发挥协同作用，共同清除活性氧物质，使活性氧维持在一个对细胞无害的稳定状态。种子老化过程中产生的自由基和过氧化物具有很强的毒害作用，可以启动膜脂中不饱和脂肪酸的过氧化作用，产生O2－，使细胞膜受到损伤，导致种子老化和组织衰老。MDA是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量的高低可以用来衡量植物在逆境胁迫下生物膜受活性氧伤害程度的大小。种子劣变过程中，脂质过氧化，膜透性增加，溶质外渗，合成能力下降，激素也发生相应的变化，SOD、CAT、POD等保护性酶的活性降低，清除自由基及过氧化物的能力减弱，自由基不断积累，攻击膜磷脂分子的不饱和脂肪酸，膜受到破坏，透性增大，积累MDA等有毒物质，造成种子活力下降。本研究结果表明，随着种子老化程度的加深，烟草种子SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性下降，MDA含量升高，种子浸出液的相对电导率也显著增加。这与前人对大豆、小麦、玉米、辣椒、大白菜、白菜研究结果相一致，表明烟草种子人工老化及劣变的主要机制也在于膜脂过氧化作用加剧。

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