miR-137对Parkin诱导的线粒体自噬的影响

作者单位：524001 湛江，广东医学院附属医院神经病学研究所 广东省衰老相关心脑血管疾病重点实验室(李文，赵斌，冯杜)；524001 湛江,广东医学院附属医院麻醉科(胡喆，杨玥)，神经内科(林智君，陈煜森，钟望涛，林春霞)

miR-137对Parkin诱导的线粒体自噬的影响

李文胡喆林智君杨玥陈煜森钟望涛林春霞赵斌冯杜

【摘要】目的探讨miR-137对Parkin诱导的线粒体自噬的影响。方法将miR-137 mimics和miR-137 inhibitor分别转染进HeLa细胞8 h后，再转染pEGEPC1-Parkin，24 h之后加羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(FCCP)处理4 h或者不加FCCP，利用免疫荧光和蛋白免疫印迹技术分析 miR-137对线粒体自噬的影响。用实时定量PCR方法检测帕金森病患者与健康对照者血液样本中miRNAs的表达情况。结果在FCCP作用下，Parkin的表达促进细胞自噬分子LC3由LC3Ⅰ型变为LC3Ⅱ型，Parkin蛋白从胞浆转位至线粒体。而细胞先经外源过表达miR-137处理之后，Parkin引起的细胞自噬受到显著抑制(P=0.003)。miR-137在帕金森病患者血液中的表达水平显著高于健康对照组(P<0.001)。结论在FCCP作用下，miR-137抑制Parkin介导的线粒体自噬。miR-137在帕金森病患者血液样本中高表达，提示miR-137可能通过调控Parkin介导的线粒体自噬，参与帕金森病的发生。

【关键词】miRNA；线粒体自噬；Parkin；帕金森病；羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.05.003

基金项目:国家自然科学青年

通讯作者，冯杜， E-mail: feng-du@foxmail.com

收稿日期：(2014-11-27)

Effect of miR-137 on Parkin-induced mitophagyLiWen,HuZhe,LinZhijun,YangYue,ChenYusen,ZhongWangtao,LinChunxia,ZhaoBin,FengDu.DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege(InstituteofNeurology,GuangdongKeyLaboratoryofAge-relatedCardiac-cerebralVascularDisease),Zhanjiang524001,China

Correspondingauthor,FengDu,E-mail:feng-du@foxmail.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of miR-137 upon Parkin-induced mitophagy. Me-thodsmiR-137 mimics and inhibitors were transfected into Hela cells for 8 h. pEGFPC1-Parkin was then transfected for another 24 h. Hela cells were treated with or without carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) for 4 h before being harvested. Immunofluorescence and Western blot were used for detecting the effect of miR-137 on mitophagy. Expression of miRNAs in blood sample from patients with Parkinson’s disease (PD) and healthy donors were measured with Real-time quantitative PCR. ResultsUnder the intervention of FCCP, the expressed Parkin promoted the conversion of LC3Ⅰ into LC3Ⅱ and translocated the Parkin protein from cytoplasm to mitochondria. After in vitro cell treatment with over-expressed miR-137, Parkin-induced mitophagy was significantly inhibited (P=0.003). The expression of miR-137 in the blood of PD patients was significantly higher than that of normal controls (P<0.001). ConclusionsmiR-137 could suppress Parkin-mediated mitophagy in the presence of FCCP. The high expression level of miR-137 in PD patients indicates that miR-137 may be involved in the incidence of PD via regulating Parkin-mediated mitophagy.

【Key words】miRNA; Mitophagy; Parkin; Parkinson disease;

Carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone

miRNA是一类非编码小RNA分子，大量研究表明，miRNA在发育、分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成以及神经退行性疾病等的发生过程中起重要作用[1-3]。miRNA可参与调控细胞自噬，可通过相关的自噬途径调控内皮祖细胞的正常自噬水平及其存活、抑制低氧诱导的线粒体自噬，例如miR-137通过抑制线粒体自噬受体FUNDC1和NIX的表达进而抑制低氧诱导的线粒体自噬[4-6]。帕金森病是一种慢性神经退行性疾病， Parkin编码基因的突变是常染色体隐性帕金森病的主要病因，其表达产物Parkin是一个E3泛素连接酶，其通过泛素蛋白酶体途径降解错误折叠的蛋白质。Parkin突变后，E3酶活性丧失，不能降解一些错误折叠或者未折叠的蛋白质，导致具有细胞毒性的底物在细胞内大量堆积，从而引起细胞死亡。除此之外，Parkin能抑制凋亡应激活化的蛋白激酶途径，对黑质纹状体多巴胺能神经元有保护作用，还可通过减弱微管相关蛋白激酶的活性，保护多巴胺能神经元免受微管解聚剂的影响[7-8]。

在正常条件下，Parkin绝大部分定位于胞质。在线粒体去极化剂羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(FCCP)处理下，Parkin从细胞质中迁移到线粒体中，并激活自噬以清除受损的线粒体[9]。线粒体自噬对于神经系统的发育和功能的维持十分重要。神经细胞依赖于自噬来控制蛋白的质量并且移除损伤的线粒体。Parkin对于维持线粒体的正常功能至关重要，线粒体功能的丧失可能在帕金森病的发生中起着重要作用[10-11]。本文通过研究miR-137对Parkin介导的线粒体自噬的影响，以及比较帕金森病患者与对照组血液样本中miR-137的表达情况，探讨帕金森病的发病机制。

材料与方法

一、材料来源

选用2013年1月至2014年1月在广东医学院附属医院神经内科住院的确诊为帕金森病的26例患者 [男15例、女11例，年龄(62±8)岁]及同期在广东医学院附属医院门诊体检的26名健康对照者[男15名、女11名，年龄(60±9)岁]的血液样本(空腹12～14 h，取血3 ml)。帕金森病患者及健康对照者的一般资料具可比性，P均>0.05。健康对照者否认有家族性及遗传性帕金森病。本研究经广东医学院附属医院医学伦理委员会批准，受试者均知情同意。

二、主要试剂

HeLa细胞为本实验室保存细胞株，培养基和血清均购自Hyclone公司，胰酶、细胞消化液、双抗、抗荧光淬灭液购自碧云天公司。Trizol(Life Technology，15596-026)，DNA酶I(包含10×反应缓冲液和氯化镁)，pEGFPC1-Parkin由本实验室构建。线粒体内膜易位酶(TIM23)抗体 (BD Biosciences，611222)，线粒体外膜受体(TOM20)抗体 (BD Biosciences，612278)，LC3B 多克隆抗体 (Sigma，L7543)，电压依赖性电离子通道(VDAC1) 单克隆抗体 (Abcam，ab14734)，Tubulin 单克隆抗体 (Earthox，E021040)，绿色荧光蛋白抗体(Santa Cruz，sc-9996)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 (Earthox，E030110)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G (Earthox，E030120) 用于蛋白免疫印迹检测。Alexa fluor 555 标记的驴抗小鼠免疫球蛋白G(Life Technologies，A31570) 用于免疫荧光检测。

三、主要方法

1.实时定量PCR检测相关miRNAs的表达

用实时定量PCR检测受试者血液样本中的10个已被报道的与帕金森病发病相关的miRNAs的表达情况(包括miR-137、miR-34b和miR-34c等)。实验操作步骤均严格按照说明书进行，具体方法为：先用Trizol法提取全血总RNA，然后行RNA样本的基因组DNA降解和反转录反应。用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒(TaKaRa，RR716)检测U6和miRNAs的表达。所有被检测的miRNAs引物和U6引物均订自广州锐博公司，检测仪器为ROCHE LightCycler480Ⅱ实时定量PCR系统，用2-△△CT法计算结果。

2. 在不同处理条件下，用免疫荧光检测Hela细胞发生自噬的情况

准备3个放有方玻片的35 mm的细胞培养皿，接种Hela细胞于上述培养皿中，待细胞完全铺展开至密度达到80%时分别作如下处理：第1组(MOCK组)为空白对照，不做任何处理；第2组(FCCP组)用FCCP(终浓度为20 μm)处理4 h；第3组(Parkin+FCCP组)转染pEGFPC1-Parkin 24 h后，再用FCCP(终浓度为20 μm)处理4 h，收集细胞进行免疫荧光检测，用Tom20抗体标记线粒体，于荧光显微镜下观察FCCP对Parkin转位的影响。

准备1个放有方玻片的6孔板，将Hela细胞接种于上述6孔板中，待细胞完全铺展开密度达到80%时做转染。转染时分组如下：第1排和第2排的3个孔都分别转染scramble NC(NC)、 miR-137 mimics(137)、miR-137 inhibitor(in-137)，转染8 h后，再转染pEGFPC1-Parkin于上述6个孔中。转染24 h后，第1排的3个孔用FCCP(终浓度为20 μm)处理4 h，第2排的3个孔不用FCCP处理，作为对照。以上6组分别记为：Parkin+NC+FCCP组、Parkin+ 137+FCCP组、Parkin+ in-137+FCCP组、Parkin+ NC组、Parkin+137组、Parkin+ in-137组。上述处理结束后，用4%甲醛固定细胞30 min，用磷酸盐缓冲液洗4次，每次5 min。0.1% Triton X-100(溶于磷酸盐缓冲液)打孔10～15 min，1%牛血清白蛋白 (溶于磷酸盐缓冲液)封闭30 min，Tom20抗体室温孵育1 h，磷酸盐缓冲液洗4次，荧光二抗Alexa fluor 555 标记的驴抗小鼠免疫球蛋白G室温孵育1 h，磷酸盐缓冲液洗4次，抗荧光淬灭液封片。用TCS SPF5 II Leica 共聚焦显微镜拍照，免疫荧光检测结果的分析参照文献[12-13]。

3. 蛋白免疫印迹检测自噬相关蛋白的表达

蛋白免疫印迹检测的细胞分组与上述免疫荧光检测6孔板的分组操作一致，其后收集细胞，细胞加入裂解液冰上裂解30 min，测蛋白浓度，于100℃加入6×上样缓冲液煮样10 min。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V转膜120 min，5%脱脂牛奶(溶于磷酸盐缓冲液)室温封闭1 h，加入相应的一抗于4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗4次，每次10 min。用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，磷酸盐缓冲液洗4次，每次10 min。采用增强化学发光法检测目的蛋白FUNDC1、NIX、Tom20、Tim23、VDAC1、LC3等的表达情况，免疫印迹检测结果分析参照文献[14]。

四、统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件处理数据。在FCCP作用下，miR-137抑制Parkin诱导的线粒体自噬的统计结果先行总体方差分析，总体有差异后，两两比较采用LSD-t检验；健康对照者与帕金森病患者血液中miRNAs的表达情况比较行独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、miR-137抑制Parkin诱导的线粒体自噬结果

在MOCK组或者在FCCP单独作用下，未见大规模线粒体自噬性降解，而FCCP+Parkin组中，pEGFPC1-Parkin+(阳性转染)细胞则发生明显的线粒体自噬(图1A)。Parkin本身不会影响线粒体自噬，Parkin只有在FCCP作用下才向线粒体转位(图1B)。在Parkin+137+FCCP组中，miR-137能显著抑制Parkin的转位，因而抑制Parkin诱导的线粒体自噬；相反，在Parkin+in-137+FCCP组中，in-137则增强Parkin的转位，加剧Parkin诱导的线粒体自噬(图1B)。随机挑选了每个处理样本的9个拍照视野，并统计了发生线粒体自噬的细胞数目，见图1D。与Parkin+ NC+FCCP组相比，Parkin+137+FCCP组中pEGFPC1-Parkin+细胞发生Parkin转位的细胞数目减少，差异具有统计学意义(P=0.003)。与Parkin+137+FCCP组相比，Parkin+in-137+FCCP组中pEGFPC1-Parkin+细胞发生Parkin转位的细胞数目增多，比较差异具有统计学意义(P=0.001)。其余各组间pEGFPC1-Parkin+细胞发生Parkin转位的细胞数相互比较的数据见表1。在Parkin+137+FCCP组中，miR-137的瞬时过表达能显著抑制线粒体蛋白如Tom20、Tim23、VDAC1的降解，并且抑制了LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型的转换。相反，抑制内源miR-137的表达之后(Parkin+ in-137+FCCP组)，Tom20、Tim23、VDAC1的表达明显减少，伴随LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型的转换增多(图1C)。

表1

各组间pEGFPC1-Parkin +

注：a与①比较，b与②比较，c与④比较

二、帕金森病患者与健康对照者miRNAs表达谱分析

与其它9个miRNAs相比，miR-137在帕金森病患者血液中的表达水平显著高于健康对照者(P<0.001，图2)。且miR-34b、miR-34c和miR-133b等9个已被报道的与帕金森病相关的miRNAs的检测结果均与文献报道相似[4-6]。各组之间相互比较的数据见表2。

讨论

由于客观原因，要获得帕金森病患者的脑组织较为困难(不像肿瘤组织那样可以通过手术获得)，因此笔者选择了帕金森病患者的外周血作为受试样本。目前，已有通过检测血液样本进行帕金森病相关研究的报道。Pihlstrøm等[15]用帕金森病患者和正常人共72例的血液样本(各36例)以及24例的大脑皮层样本(各12例)检测SNCA基因的单核苷酸多态性，SNCA mRNA的表达水平以及SNCA第1个外显子的甲基化水平，发现脑组织中SNCA的甲基化方式与血液中SNCA的甲基化方式一致[15]。Potashkin等[16]取早期帕金森病患者、神经退行性疾病患者和正常人的外周血样本行mRNA芯片检测，旨在发现早期帕金森病患者与正常人外周血中mRNA表达的差异。参考上述经验，本研究采用外周血细胞作为研究帕金森病的样本是可行的。

图1　miR-137抑制Parkin诱导的线粒体自噬

A:可见Parkin+FCCP 组中的pEGFPC1-Parkin+细胞(绿色)发生了线粒体自噬现象，Parkin由胞浆转位至线粒体，与线粒体标记蛋白Tom20(红色)形成了定位(白色箭头)，MOCK组与FCCP组未见此现象。B:FCCP作用的各组中，与in-137组相反，在miR-137作用下，pEGFPC1-Parkin+细胞的线粒体自噬现象减少，比例尺20 μm。C:蛋白免疫印迹检测，条带下方数字是相对应的灰度分析结果。D:pEGFPC1-Parkin+细胞发生线粒体自噬的统计图，Parkin+NC+FCCP组与Parkin+137+FCCP组比较，**P<0.01；Parkin+137+FCCP组与Parkin+in-137+FCCP组比较，***P<0.001

图2帕金森病患者及健康对照者

血液中miRNAs表达谱分析

黑色：帕金森病患者；灰色：健康对照者，***为P<0.001

表2

帕金森病患者与健康对照者

注：A=健康对照者miRNA/健康对照者miR-137

miRNA 与神经细胞的发育和神经退行性疾病的发病密切相关。miR-7和miR-153能在转录水平负调控α-突触核蛋白[17-18]。运用生物芯片技术，在帕金森病患者以及帕金森病小鼠模型的中脑中均检测到miR-133b的表达减少。此外，芯片测序结果显示，帕金森病患者的脑病变区域(包括额叶皮质、杏仁核、黑质和小脑)中miR-34b/34c的表达均下调，与本文在血液标本中的检测结果一致[19]。有研究显示，FGF20 mRNA 3’UTR存在多态性位点rs12720208，而miR-433正好结合在该区域，在neuro2a神经母细胞瘤细胞中过表达miR-433，将抑制C等位基因的表达，而与帕金森病相关的T等位基因则不受影响[20]。LRRK2基因突变与帕金森病的发生相关，外源过表达let-7或miR-184，将减弱LRRK2带来的病理性损伤[21]。miR-137在脑中的高表达对于胚胎神经干细胞的分化至关重要[22]。Mind Bomb-1是神经发育过程中重要的泛素连接酶，miR-137通过调节其表达来调节神经元的成熟[23]。但是，在帕金森病患者中，miR-137作用的具体分子机制还有待进一步研究。

miR-137能通过抑制线粒体自噬受体FUNDC1和NIX的表达，调节低氧诱导的线粒体自噬[6]。还有研究发现，NIX是Parkin移位至线粒体的关键成分[24]。本研究在既往的研究基础上，进一步深入探索了miR-137对于Parkin/FCCP通路诱导的自噬的影响。结果表明，在FCCP作用下，miR-137能抑制Parkin从胞质转位至线粒体，并抑制了线粒体蛋白如Tom20、Tim23、VDAC1的降解以及LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型的转换，因而减弱了线粒体自噬程度。

miR-137在帕金森病患者血液中的表达显著高于对照组，因此我们推测，miR-137能抑制Parkin诱导的线粒体自噬，miR-137表达高，则Parkin诱导的线粒体自噬水平低，而细胞内低水平的自噬恰好是帕金森病的诱因之一[10-11]。综上所述，对Parkin的进一步研究，尤其是对其作用方式和功能的研究，将有助于阐明帕金森病的发病机制，为帕金森病的治疗提供新的策略。

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(本文编辑：洪悦民)

基础研究论著