脑泰方对动脉粥样硬化兔氧化应激的影响研究



脑泰方对动脉粥样硬化兔氧化应激的影响研究

刘吉勇1，朱惠斌2，陈懿3，王国佐3，易亚乔3，葛金文3*

（1.湖南中医药大学中医诊断研究所湖南省重点实验室湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院湖南长沙410007；3.湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南长沙410208）

〔摘要〕目的观察脑泰方对动脉粥样硬化兔氧化应激的影响，探讨脑泰方抗动脉粥样硬化的作用机制。方法采用“高脂饲料喂养+免疫刺激方法”建立动脉粥样硬化兔模型，模型成功后随机分为脑泰方组、模型组、阿托伐他汀组，另设空白对照组，每组10只。药物干预后，采用酶联免疫法测定兔血清SOD、MDA及ox-LDL含量；采用PCR及Western Blot技术检测LOX-1、VCAM-1、ICAM-1及MCP-1相关基因及蛋白表达情况。结果模型兔SOD较空白对照组显著降低（P<0.01)，MDA及ox-LDL显著升高（P<0.01)，主动脉LOX-1、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1mRNA和蛋白表达较对照组显著升高（P<0.01)。药物干预后，与模型组比较，脑泰方组兔SOD明显升高（P<0.01)，MDA及ox-LDL含量明显降低（P<0.01)，LOX-1、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1 的mRNA和蛋白质表达明显下降（P<0.01)。结论脑泰方可能通过增强抗氧化能力，降低脂质过氧化程度及保护血管内皮的途径而发挥抗动脉粥样硬化作用。

〔关键词〕脑泰方；动脉粥样硬化；氧化应激；黄芪；川芎；地龙

动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)引起的心脑血管疾病严重危害着人类健康，在欧美一些国家已经成为危及人类健康的一号杀手。在引起动脉粥样硬化的众多因素中，高胆固醇血症、脂质过氧化、炎症反应是重要的危险因素，但动脉粥样硬化的发病机制较为复杂,至今尚不明确。近年大量研究证实，氧化应激(oxidative stress OS)贯穿动脉粥样硬化斑块的形成、发展及斑块破裂触发临床事件的始终，被认为是其致As发生、发展的重要机制之一[1]。氧化应激主要通过氧化作用、诱导血管基因表达，促进局部炎症反应和细胞增殖等多方面参与动脉粥样硬化的发生与发展[2]。中医认为As多为本虚标实，本虚以气虚为主，标实以血瘀、痰浊为主[3]。中药复方多成分、多靶点的整体调治符合动脉粥样硬化复杂的病机特点，且疗效稳定，副作用小。脑泰方是由补阳还五汤化裁而成的治疗动脉粥样硬化的临床有效验方。前期研究表明，脑泰方能提高纤溶酶原激活物（t-PA）的活性，抑制血小板的聚集，具有抗血栓形成、促进纤溶活性的作用[4]。本研究基于氧化应激角度，进一步探讨其对氧化应激相关效应分子的影响，以期明确其抗As的作用机制。

1　材料

1.1实验动物

1.2实验药物

脑泰方：由黄芪、地龙、川芎等组成，由湖南中医药大学制剂实验室提供的中试样品，批号为20090801，含生药2 g/g。阿托伐他汀钙：Pharmaceuticals，产品批号：5837030。

1.3主要试剂

牛血清白（蛋白Roche公司）；SOD、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；ox-LDL ELISA试剂盒（美国CSF公司）；MCP-1抗体（Abcam公司）；VCAM-1抗体、ICAM-1抗体、LOX-1抗体(Santa cruz biotechnology公司)；卵血清白蛋白、小鼠Actin、制胶、电泳和转膜试剂（美国Sigma公司）；HRP标记兔抗小鼠二抗（KPL公司）；蛋白抽提试剂盒、HaltTM蛋白酶抑制剂、SuperSignal West Femto超灵敏化学发光底物、BCA protein定量试剂盒（Pierce公司）；PVDF膜、SeeBlue Plus蛋白预染Marker、Trizol Reagent（美国Invitrogen公司）；RTPCR试剂盒(大连Takara生物公司)；TBE电泳缓冲液、100-1000bp DNA marker(北京天根生物公司)。

2　方法

2.1动物分组

动物给予普通饲料适应性饲养1周。采用随机数字表法分为空白组，模型组，脑泰方组，阿托伐他汀组，每组20只。均单笼饲养，饮水不限，自由摄食，每天每只予150 g饲料。

2.2造模方法

黍粒小，播种浅加上春天风大、干旱，如果种子不能与土壤紧密结合，种子难以吸水发芽，因此黍子播种后及时镇压1-2次。

除空白组外，其他组参照文献[5]采用喂高脂饲料加血管内膜免疫刺激方法进行造模。高脂饲料按普通饲料79%、胆固醇1%、猪油5%、蛋黄粉15%比例配制。造模第1天从兔耳缘静脉注射牛血清白蛋白进行免疫刺激(25 mg/kg，1次/周，共注射3次)，之后用卵清白蛋白进行皮下注射(2.5 mg/kg，1次/2 d，共5次)，造模时间8周,通过检测血脂及主动脉病理检测评判模型的成功，最终筛选出每组10只。

2.3给药方法

模型成功后，开始灌胃给药，每天1次，灌胃时间1个月。各药物剂量根据70 kg成人每日临床推荐的常用剂量及人兔体表面积换算为等效剂量。阿托伐他汀组予阿托伐他汀混悬液灌胃，剂量为0.435 mg/（kg·d），脑泰方组为0.2 g/（kg·d）；正常对照组、模型组予生理盐水灌胃。

2.4指标的检测及方法

2.4.1血清SOD、MDA、ox-LDL的测定用黄嘌呤氧化酶法检测总SOD活力；硫代巴比妥酸反应法测定血清丙二醛（MDA）；夹心酶联免疫吸附法测定血清ox-LDL的含量；操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.4.2兔胸主动脉ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、LOX-1 mRNA表达采用RT-PCR法检测。按照试剂盒说明书提取胸主动脉组织的总RNA，以1.5 %凝胶电泳分析总RNA的完整性，用紫外分光光度计测A260 nm和A280 nm值进行定量。逆转录反应（RT）操作参照大连TaKaRa公司提供的RT-PCR试剂盒说明书，建立10μL反应体系，将反应体系快速混匀一次，按以下条件进行RT：30℃10 min；42℃30 min；99℃5 min；5℃5 min。RT产物立即行PCR试验，建立10 μL PCR扩增反应体系，PCR反应条件：ICAM-1的扩增条件：95℃1 min；95℃30 s，57℃30 s，72℃40 s，共30个循环，72℃延伸5 min；VCAM-1的扩增条件：95℃1 min；95℃30 s，59℃30 s，72℃40 s，共32个循环，72℃延伸5 min；MCP-1的扩增条件：95℃1 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，共35个循环，72℃延伸5 min；LOX-1的扩增条件：95℃1 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共30个循环，72℃延伸5 min，PCR产物5 μl 与5×loading buffer 1 μL混匀后，加入1.5%琼脂糖凝胶板，100 V恒电压电泳20 min后紫外灯光下观察条带，并应用自动电泳凝胶分析系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段进行光密度扫描，并以β-actin密度作为参考定量标准，分析电泳结果。引物序列见表1。

表1　引物名称、序列及扩增长度

2.4.3腹主动脉ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、LOX-1蛋白的表达采用Western-Blot法检测。按照试剂盒操作要求，首先提取腹主动脉组织总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，取出膜，装入保鲜膜袋中，加稀释的一抗体（1:5 000），37℃孵育1 h。洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000），用ECL进行显色，放入暗盒中曝光、显影、定影。凝胶图像处理系统测定目的条带的光密度值，计算其与Actin光密度值的比值，即相对光密度。

2.5统计学分析

采用SPSS 16.0处理及分析数据。计量资料以“x±s”表示，两组间均数比较用t检验，多均数组比较进行方差齐性检验后采用用One-Way ANOVA分析，两两比较采用LSD法。

3　结果

3.1血清SOD、MDA、ox-LDL分析结果

与空白组比较，模型组血清MDA、ox-LDL含量明显升高(P<0.01)，SOD活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较，脑泰方组血清SOD活力升高，血清MDA、ox-LDL含量降低（P<0.01，P<0.05）。结果见表2。

表2　各组家兔血清SOD、MDA、ox-LDL含量　（x±s，n=10）

3.2胸主动脉LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA基因表达结果

RT-PCR检测结果显示，与空白组比较，模型组LOX-1、MCP-1、ICAM-1及VCAM-1 mRNA的表达明显升高（P<0.01），与模型组比较，脑泰方组LOX-1、MCP-1、ICAM-1及VCAM-1 mRNA的相对表达量明显下降（P<0.05或P<0.01）。结果见表3、图1。

图1　PT-PCR检测各组兔胸主动脉LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1基因表达

Western-blot结果显示，与空白对照组比较，模型组腹主动脉LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，脑泰方组腹主动脉LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达明显下降（P<0.05或P<0.01）。结果见表4、图2。

表3　各组家兔胸主动脉基因表达水平变化　（x±s）

表4　各组家兔腹主动脉蛋白表达水平变化　（x±s）

图2　Western-Blot检测各组兔腹主动脉LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达

4　讨论

本实验采用高脂饲料喂养加免疫刺激方法复制动脉粥样硬化兔模型，大量研究表明,高脂血症可导致氧自由基及其他活性成分释放增多，引起动脉内皮损伤[6]。MDA是脂质过氧化的最终分解产物，MDA含量多少可以间接反映出机体组织中氧自由基含量的变化以及氧自由基引起脂质过氧化程度，从而可以判断组织损伤程度，是常用的膜脂过氧化指标，脂质过氧化损伤在冠心病、动脉粥样硬化等疾病的发病中日益受到重视。SOD是机体内天然存在的氧自由基清除因子，它在维持机体氧化和抗氧化系统的平衡中起着重要的作用，检测SOD的含量的高低可以间接反映出机体清除自由基的能力。因此检测SOD，MDA的含量可反映机体清除氧自由基的能力和脂质过氧化程度[7]。

氧修饰LDL形成的ox-LDL是内皮细胞及平滑肌细胞损伤的主要原因，其本身对单核细胞有趋化作用，能促使内皮细胞产生巨噬细胞集落刺激因子和趋化因子，从而刺激新的单核细胞进入病变及单核细胞源的巨噬细胞复制。正常情况下，血管内膜表面无炎症，但氧化应激时很多促炎性因子刺激剂诱导内皮细胞黏附分子表达，导致单核细胞黏附，最终形成As损伤。氧化应激是As炎症反应的始动因素，其中ROS及其修饰LDL形成的ox-LDL是内皮细胞损伤和诱导内皮细胞促炎性因子表达的主要原因[8]。大量研究结果证实，在早期As形成过程中，血管内皮细胞黏附分子的表达与白细胞相互黏附具有重要的病理生理学意义[9]。本研究结果进一步证实，随着机体氧化应激作用增强，体内脂质代谢产物MDA含量增高，SOD活性显著降低，体内氧化-抗氧化系统失衡，过量的ROS及具有细胞毒性作用的氧化型LDL能诱导内皮细胞促炎性因子表达和加剧内皮细胞损伤。本实验PCR结果显示模型组MCP-1、ICAM-1、VCAM-1等促炎症因子呈过表达。

脑泰方是临床治疗动脉粥样硬化气虚痰凝，痰瘀互结证的有效方剂，方中以黄芪为君药，借其力专、性走，周行全身，大补脾胃元气，令气旺则血活，血活则瘀除，以治其本；川芎活血行气，气行则血行，是为臣药；地龙通经活络，化痰熄风，是为佐药。诸味配合，共奏益气、活血、化瘀、祛痰之功效。既往研究显示，脑泰方对血脂、血管微循环、血液流变学、血液凝血与纤溶系统、促进血管新生方面有一定影响[10-11]。本研究结果显示，脑泰方能降低血脂，降低脂质过氧化MDA的产生，增强SOD酶抗氧自由基的活力，减少ox-LDL的生成，从而保护内皮细胞，改善机体氧化应激状态。ox-LDL能诱导内皮细胞LOX-1受体表达及诱导内皮细胞产生粘附分子，脑泰方可能通过抑制这一作用机制，从而下调LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的表达，减少了内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞对ox-LDL的摄取，从而抑制泡沫细胞的形成，进而保护内皮功能及抑制As的发生发展，其治疗作用与阿托伐他汀无明显差异。

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（本文编辑杨瑛）

着密切联系，CaMK IV作为CaMK家族中的一员，在中枢神经系统中表达较丰富。CaMK IV作为CREB的上游基因之一，对CREB的磷酸化发挥着重要作用。CaMK IV可通过p-CREB参与学习、记忆的巩固和维系，CaMK IV-CREB信号通路直接参与了LTP的形成，是维持学习、记忆功能的重要通路[10]；同时在神经递质的合成与释放、神经发育、突触可塑性及基因表达等方面发挥着重要作用。

Effects of Naotaifang on Oxidative Stress in Rabbits with Atherosclerosis

LIU Jiyong1, ZHU Huibing2，CHEN Yi3, WANG Guozuo3, YI Yaqiao3, GE Jinwen3*

（1. Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine,Changsha, Hunan 410007, China;2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha, Hunan 410007, China; 3.Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases Prevention and Treatment of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

Abstract〔〕Objective To observe the effects of Naotaifang on oxidative stress in rabbits with atherosclerosis and investigate its molecular mechanisms. Methods The atherosclerosis rabbit models were prepared by feeding the high fat diet and immune stimulation. After the success of the model animals were randomly divided into Naotaifang group, model group, atorvastatin group and blank control group(n =10). After drug intervention，the serumsuperoxide dismutase(SOD)activity，malondialdehyde(MDA)and oxidized low density lipoprotein(ox-LDL)levels in rats were detected by enzyme linked immunosorbent assays. The LOX-1, VCAM-1, ICAM-1 and MCP-1 related gene and protein expression were detected by using PCR and Western Blot technology. Results Compared with the control group, serum SOD activity in tat models was significantly decreased(P<0.01), serum MDA，ox-LDL was significantly higher(P<0.01); mRNA and protein expression of aortic LOX -1，VCAM -1，ICAM -1，and MCP -1 were significantly increased(P <0.01)．After medicine intervention, compared with model group，SOD in rabbits of Naotaifang group was increased significantly(P<0.01), MDA and ox-LDL were significantly lower(P<0.01), mRNA and protein expression of aortic LOX-1，VCAM-1，ICAM-1，and MCP-1 were significantly lower(P<0.01). Conclusion Naotaifang has anti-atherosclerotic effects, it may through enhancing antioxidant capacity, reducing lipid peroxidation and protecting the vascular endothelium pathways.

Keywords〔〕Naotaifang; atherosclerosis; oxidative stress; milkvetch root；rhizoma ligustici；lumbricus

〔通讯作者〕*葛金文，男，教授，博士研究生导师，E-mail：cmgjw@tom.com。

〔作者简介〕刘吉勇，女，硕士，讲师，从事中西医结合防治心脑血管疾病研究。

〔基金项目〕湖南省科技厅项目（2012IP4018-2）；湖南省教育厅项目（600110410）；国家重点学科中医诊断学开放基金（2014）；湖南中医药大学青年教师科研基金资助。

〔收稿日期〕2015－01－16

〔文章编号〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.10.007

〔文献标识码〕B

〔中图分类号〕R285.5;R256.22