砂引发对甜玉米种子几种酶活性的影响

张皖秋， 孙海燕， 张文明， 郑文寅， 高灿红， 姚大年

（1.安徽农业大学农学院， 合肥230036； 2.潍坊学院生物与农业工程学院， 安徽 潍坊261061）

甜玉米（Z.m.saccharata Sturt）为玉米属亚种，即甜质型玉米亚种，原产地在美洲，西欧称之为蔬菜玉米，现已成为一种新兴的果蔬兼用型保健食品［1］。甜玉米受相关隐形基因突变的影响，促使可溶性糖转化为淀粉的速率降低，因而甜玉米籽粒的含糖量比普通玉米高出2～8倍。甜玉米商业价值较高，也有很大的转化增值空间，但是我国对甜玉米的开发和利用进展却较缓慢，原因在于甜玉米种子的活力弱，田间出苗率低，特别是超甜玉米，仅有50%左右［2－3］。因此，如何提高甜玉米种子活力成为种子领域的重要研究课题。

种子引发也称为渗透调节，是提高种子活力方法之一，此方法最早由 Heydecker等［4］提出，是指控制种子处于吸胀的第二阶段，促进种子缓慢吸收水分，促进酶的活化，进行预发芽的生理生化代谢，同时，也要防止胚根伸长［5］。常用的种子引发方法有固体基质引发、渗透引发、生物引发等［6］。研究发现，引发处理增强了种子活力、提高了种子的发芽速度、成苗率和整齐度，甚至可以增强种子的抗逆性，可一定程度的减少种子用量，节约成本［7］。胡晋等对直播水稻种子进行砂引发处理，结果表明：经砂引发处理后的水稻种子，与活力相关的一些酶活性均得到显著提高［8］。张文明等采用不同含水量的砂引发处理草坪草种子，探究对其萌发及活力的影响，结果表明：各处理中种子的发芽势、发芽率、幼苗的鲜重、干重及简化活力指数均得到明显提高［9］。王芳等以水、硝酸钾、硝酸钾与磷酸二氢钾混合溶液3种基质对甜玉米种子进行引发处理，结果表明：3种引发处理对甜玉米种子的发芽率影响不大，但均能促进芽鞘和单株幼苗的生长和提高种子的活力［10］。Chem等研究发现，甜玉米种子在－0.3MPa PEG溶液中引发可提高种子的发芽率［11］。Resse等对甜玉米种子进行加压融合生物引发，结果表明：此方法不仅能增大吸湿速率，还能使金色假单胞菌在种子表面大量繁殖，明显提高田间出苗率［12］。

本试验选用7个品种甜玉米种子为材料，每品种设置水分含量为5.7%和7.4%的2种砂引发处理，设未处理种子为对照，通过测定各处理脱氢酶、POD和Apase的活性，并进行过氧化物酶和酸性磷酸酶电泳分析，研究砂引发对甜玉米种子酶活性的影响，探讨砂引发提高甜玉米种子活力的生理生化机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试甜玉米品种共有7个，分别为：皖玉14号、皖玉15号、皖玉10号、皖甜1号、双福超甜、粒粒丰超甜、金菲超甜。

1.2 试验方法

1.2.1 砂引发处理

在前期试验的基础上选择水分含量为5.7%和7.4%的2种砂引发处理。参照张文明等［9］的试验方法，先将砂子清洗数次，装盘后放入130℃烘箱烘干，再用孔径为d＝2.0mm的筛子筛去杂物。各处理以种子重量和干砂重量1∶5的比例，随机取一定量的玉米种子（约1 000粒）和相应重量的干砂，干砂放入培养盒内，按砂水分含量为5.7%和7.4%的要求，加水并充分搅拌。再将相应的玉米种子倒入砂中，拌匀，加盖密封后放入20℃培养箱中处理3d。设不作任何处理种子为对照。

1.2.2 酶活性测定

对处理后的7个品种的甜玉米种子进行脱氢酶、POD、Apase活性的测定，以不作处理的种子为对照。脱氢酶活性测定参照尹燕枰等［13］的试验方法，采用氮蓝四唑（TTC）法，测定490nm处的OD值。POD活性测定参照刘子凡［14］的试验方法，稍加改动。Apase活性的测定参照程军等［15］的试验方法，稍加改动。

1.2.3 过氧化物酶同工酶电泳

试验步骤及方法参照孙海燕［16］的试验方法。

1）分离胶缓冲液：取10.98g的 Tris，14.4mL 1mol／L的 HCl和0.2mL的TEMED，加适量蒸馏水至30mL。

2）分离胶贮液：取14.0g的Acr和0.368g的Bis，加适量蒸馏水至50mL。

3）过硫酸铵溶液：取0.7g的过硫酸铵，加适量蒸馏水至50mL。

4）浓缩胶缓冲液：取1.196g的 Tris，9.6mL 1mol／L的 HCl，0.3mL的 TEMED，加适量蒸馏水至20mL。

5）浓缩胶贮液：取3.0g的Acr和0.75g的Bis，加适量蒸馏水至30mL。

6）蔗糖溶液：取20g的蔗糖，加蒸馏水至50mL。

7）电极缓冲液：取7.2g的甘氨酸和1.5g的Tris，加适量蒸馏水至250mL，再稀释10倍。

8）1mol／L HCl溶液：取4.2mL的 HCl，缓慢加适量蒸馏水至50mL。

9）提取用液：取10mL的蔗糖液和2mL的电极缓冲液，加8mL蒸馏水。

10）0.1%溴酚蓝溶液（前沿指示剂）：取30mg的溴酚蓝，加30mL蒸馏水。

11）染色液：取25mL的联苯胺溶液（0.5g联苯胺＋3.75mL冰醋酸），25mL 5% 的 EDTA，25mL 4%的氯化铵溶液，250μL 30%的 H2O2，混合后定溶至100mL。

样品提取：各品种取相同数量的甜玉米种子，均匀播于砂床，放置在人工智能气候箱（30℃、黑暗）培养4d，定期检测温度，观察芽苗长势，芽鞘长出后，剪下胚芽，放入研钵，滴加6滴提取液，再加入少量石英砂，充分研磨后倒入离心管，以5 000r／min的转速离心15min，吸出上清液，供点样使用。

制胶：将之前配制好的试剂1），2），3）和蒸馏水按1∶2∶4∶1的比例配制成分离胶液，倒入安装好的胶膜中。再将配制好的试剂4），5），3），6）按1∶2∶1∶4的比例配制成浓缩胶液，等分离胶液凝固后倒入浓缩胶液。在插样品梳的时候，要防止产生气泡。凝胶制好后放置30min，确保其完全聚合。

进样和电泳：用移液枪吸取20μL样品提取液，加入浓缩胶样品槽，再将之前配制好的电极缓冲液缓慢倒入电泳槽，至淹没电极，最后向前槽加2滴溶液10）。电流设为32mA，当指示剂到达电泳槽底部的时候，终止电泳。

染色：取出胶板，用蒸馏水把凝胶片冲洗两遍，放在装有染色液的容器里，观察谱带显色清楚时，立刻取出，用蒸馏水将多余的染色液洗去，并拍照。

1.2.4 酸性磷酸酶同工酶电泳

参照过氧化物酶同工酶电泳的试验方法。染色液的配制：取100mgα－醋酸萘酯钠盐和100mg固蓝B盐，100mL 0.1mol／L pH＝5.0的醋酸缓冲液，混匀待用。

2 结果与分析

2.1 砂引发对甜玉米种子酶活性的影响

由图1可见，2种砂引发处理的甜玉米种子脱氢酶活性均比ck高。2种砂引发处理间比较，除金菲超甜5.7%的砂引发处理脱氢酶活性比7.4%处理稍高外，其余品种7.4%的砂引发处理脱氢酶活性均高于5.7%处理。其中，皖甜1号、粒粒丰超甜和双福超甜7.4%处理的脱氢酶活性与ck相比增高幅度较大。

图1 砂引发甜玉米种子脱氢酶活性测定结果

由图2可见，2种砂引发处理的甜玉米种子POD活性，除皖玉14号POD活性低于ck外，其他品种的POD活性均高于ck，其中，双福超甜5.7%的砂引发处理POD活性与ck相比增高幅度较大。

图2 砂引发甜玉米种子POD活性测定结果

由图3可见，2种砂引发处理的甜玉米种子Apase活性均比ck高，其中皖甜1号5.7%的处理和粒粒丰超甜7.4%的处理，Apase活性与ck相比增高幅度较大。

2.2 砂引发甜玉米种子同工酶谱带分析

由图4可见，5.7%和7.4%2种砂引发处理的甜玉米种子，过氧化物酶同工酶谱带均比对照清晰，且多出1～2条。

由图5可见，5.7%和7.4%砂引发处理的甜玉米种子，酸性磷酸酶同工酶谱带除皖玉14号外，其余各品种砂引发处理的谱带均比对照颜色深。

3 讨 论

研究表明，引发处理能使种子的RNA和蛋白质的合成发生变化，还能诱导细胞膜的修复，增加萌发种子中ATP的含量，提高萌发种子相关酶的活性等一系列的生理生化变化，甚至能提高种子的抗逆性和出苗率，使之能在低温、高温、干旱、盐渍或者缺氧的不利环境下萌发，最终达到有效地提高种子活力的目的［17］。种子引发可提高一些与抗劣变相关的酶活性，如提高POD的活性，通过降低生物体内的H2O2含量，从而达到保护细胞和增强种子的抗逆性的作用［18］。张海艳等研究发现，沙引发处理能提高糯玉米、爆裂玉米和甜玉米幼苗过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，也能显著降低丙二醛（MDA）的含量［19］。本研究结果表明，适宜含水量的砂引发能明显提高甜玉米种子的脱氢酶、POD和Apase活性，这与前人的研究结果基本一致。本研究砂引发处理过氧化物酶同工酶谱带均比对照多出1～2条，是否为新的同工酶出现，还需要进一步研究。

图3 砂引发甜玉米种子Apase活性测定结果

种子引发是提高种子活力的有效方法之一，但引发的效果在种、品种或种子批之间可能会存在一定的差异，引发条件也难以设定统一的标准，这就给种子引发技术的推广应用带来困难。此外，各种引发方法也都存在一定的局限性，如PEG引发，由于其成本相对较高，适用于一些经济价值较高的种子；而滚筒引发不但要有一定的设备基础，而且每次引发的种子有限。相比而言，砂作为一种既便宜又容易得到的物质，并且对作物种子无毒性，可当作一种优良的引发基质［20］。此外，砂引发方法简单，可操作性强，从砂中筛出引发处理后的种子，可直接用于播种，也可连同砂一起播入田里，因此，砂引发具有较好的实际应用价值。

图4 砂引发甜玉米过氧化物酶电泳图谱

图5 砂引发甜玉米种子酸性磷酸酶电泳图谱

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