斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性*

杨移斌 杨秋红 胥 宁 董 靖 刘永涛 艾晓辉①

(1. 中国水产科学研究院长江水产研究所 武汉 430223; 2. 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心 武汉 430223)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 主要试剂 普通营养琼脂、普通营养肉汤、水解酪蛋白琼脂(Casein hydrolysate agar, 中文别名:M-H琼脂)、脑心浸出液(Brain Heart Infusion, BHI)、革兰氏染色液、药敏纸片及细菌生化微量鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司; PCR所用试剂、特异性引物及细菌基因组DNA提取试剂盒均购自上海生工。

1.2 方法

1.2.2 细菌分离实验 选择腹部出血濒临死亡的斑点叉尾10尾, 在无菌环境下取其肝、肾脏、脾脏、血水及腹水用于细菌分离, 用接种环蘸取各样品于NA及 BHI平板上划线, 恒温 28℃培养 24h后, 挑取颜色相近、大小相同及数量较多的菌落再纯化, 将分离得到的菌株与 25%甘油混匀后置于－80℃冰箱,命名为zy02。

1.2.3 回归感染及LC50测定

人工感染 将 zy02菌株接种于 NA平板, 恒温28℃培养18 h, 用无菌生理盐水洗下菌苔, 并调整菌悬液浓度为5.8 × 108CFU/mL。

细菌 LC50测定 将分离的病原菌制成的菌悬液分别稀释成 6.4×104、6.4×105、6.4×106、6.4×107、6.4×108、6.4×109CFU/mL, 然后分别从腹鳍基部注射到健康的斑点叉尾体内, 进行攻毒实验, 每尾注射剂量为0.1mL。对照组的斑点叉尾注射等量的无菌生理盐水, 实验组及对照组均设置2个重复每组的实验鱼各10尾, 水温保持在23—25℃。实验周期为7d,连续观察斑点叉尾活动情况, 并记录实验鱼的死亡尾数, 并用概率单位图解法(徐叔云等, 2002)计算半数致死浓度(LC50)。

1.2.4 zy02菌株生理生化特性测定 将zy02菌株划线于NA及BHI平板上, 恒温28℃培养24h后, 观察菌落大小、形态特征及其颜色, 并进行革兰氏染色,采用细菌生化微量鉴定参照文献(东秀珠等, 2001)测定生理生化指标。

1.2.5 细菌16S rDNA与gyrB基因测序

模板制备 将菌株 zy02接种于营养肉汤中,置于摇床恒温 28℃摇荡(200r/min)18 h, 将菌液经高速离心后收集菌体, 提取DNA即作为PCR模板。

16S rDNA 测序 引物为 27F: 5′-AGAGTT TGATC(C/A)TGGCTCAG-3′, 反向 1492R: 5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′。参照璟祝琳等(2010)方法进行 PCR反应扩增目的基因。扩增产物确定为目的片段后送上海生工纯化及序列测定。

gyrB 测序 引物参照 Yamamoto等(1995)为UP1(正向引物): 5′-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCNGGN GGN AAR TTY GA-3′, UP2(反向引物): 5′-AGCAGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCNGCR TCN GTCAT-3′。PCR 反应条件为参照邴旭文等(2009)。扩增片段送上海生工纯化测序。

构建系统发育树 将zy02菌株16S rDNA及gryB基因与 GenBank中已有序列进行比对, 根据比对结果检索出同源性较高的序列采用Clustal X软件进行多序列匹配分析, 通过 MEGA5.1软件Neighbor-Joining法构建系统进化树, 1000次Bootstrap检验置信度。

1.2.6 zy02菌株药物敏感性实验 本次通过K-B法, 将菌株zy02接种于营养肉汤中, 28℃震荡(200r/min)18h调整菌液浓度为1.0×107CFU/mL, 取稀释菌液 200μL均匀涂布于水解酪蛋白琼脂培养基上, 贴上不同的药敏纸片, 恒温28℃培养24h后测量抑菌圈直径(mm), 根据杭州微生物试剂有限公司药敏纸片抑菌圈标准确定致病菌株对药物的敏感程度。

2 结果

2.1 临床诊断

2.2 细菌分离

2.3 细菌鉴定

分离菌株 zy02为革兰氏阴性杆菌, 无运动性, 详细理化特性如表1所述, zy02菌株理化特性与中间气单胞菌Aeromonas media一致。通过将16S rDNA及gyrB序列分析的结果与NCBI基因库中已有序列比对, 结果显示菌株 zy02与气单胞菌属种类同源性最高, 通过构建系统发育树分析(图 2, 图 3), 其结果显示菌株 zy02与中间气单胞菌Aeromonas media聚为一支, 同源性达到99% (图2, 图3)。综合生理生化特征测定结果, 菌株zy02判定为中间气单胞菌Aeromonas media。

图1 斑点叉尾死亡率(%)与菌液浓度对数[lg(CFU/mL)]的关系曲线Fig.1 Relationship between I. punctatus mortality and logarithmic bacterial concentration

2.4 药敏特性

药敏特性研究结果显示: 菌株zy02对环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考及诺氟沙星等13种药物高度敏感;对红霉素中度敏感; 对阿莫西林、 磺 胺异 噁 唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。具体见表2。

3 讨论

气单胞菌按照新的分类方式, 隶属于新建的气单胞菌科(Colwellet al, 1986), 是兼性厌氧革兰氏阴性杆菌种类。气单胞菌大部分种类广泛分布于水体、污泥、土壤及空气中, 其中数种如嗜水气单胞菌(陆承平, 1992)、维氏气单胞菌(马志宏等, 2009)、温和气单胞菌(刘方等, 2016)及杀鲑气单胞菌(杨嘉龙等, 2007)等都是水生动物重要病原菌, 可引起多种水产动物如斑点叉尾(刘堂水等, 2006; 梁万文等, 2007; 耿毅等, 2007)、大鲵(凌空等, 2015)、锦鲤(姜艳丽,2015)、南方大口鲶(贺蓉等, 2005)、西伯利亚鲟(马志宏等, 2009)及黄颡鱼(刘方等, 2016)等大量死亡。而中间气单胞菌对水生动物致病的报道相对较少, 仅黄文明等(2013)报道了中间气单胞菌引起胭脂鱼发病及王高学等(2007)报道了中间气单胞菌引起刺参腐皮病。本研究通过病原分离纯化鉴定及人工感染等实验,证实了本次斑点叉尾出血性死亡是由中间气单胞菌感染引起的, 在国内尚属首次报道。水生动物出血病一般由气单胞菌种类引起, 但可能因地域差异、养殖水域环境及养殖种类等不同, 导致发病的病原也不尽相同, 本次报道中间气单胞菌引起斑点叉尾出血性死亡, 为斑点叉尾疾病防控提供了新的参考依据。

表1 菌株zy02生理生化特征Tab.1 Physiologic and biochemical characteristics of strain zy02

图2 zy02株根据16S rDNA基因序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of strain zy02

图3 zy02株根据gyrB基因序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequence of strain zy02

表2 zy02药敏试验结果Tab.2 Antibiotic sensitivity test on strain zy02

本对菌株zy02鉴定时, 不仅测定了其理化特性,而且对其16S rDNA和gyrB基因序列进行了分析, 从分子角度进行鉴定。gyrB基因即促旋酶(Gyrase)的B亚单位基因, 该基因序列全长约为 1.2—1.4kb, 其平均碱基替换率为 100万年替换 0.7%—0.8%, 比 16S rDNA基因的每5000万年替换1%的替换率要快, 因此 gyrB基因具有更高的分辨率, 特别在区分和鉴定近缘菌种方面较16S rDNA基因更具优势(郝云婕等,2008), 从而使得本次中间气单胞菌的鉴定结果更加准确。

在病害防控过程中使用抗生素进行治疗, 以达到减少经济损失的目的通常采用的措施之一。但随着疾病暴发频率及规模不断升级, 抗生素滥用时有发生, 在此过程中很可能产生大量耐药菌株。本次以19种抗生素对分离菌株 zy02进行了药敏测定, 结果显示菌株 zy02对阿莫西林、 磺 胺异 噁 唑、克林霉素及利福平等5种抗生素耐药。黄文明等(2013)研究表明来自胭脂鱼体内分离的中间气单胞菌对庆大霉素、氟苯尼考等高度敏感, 对利福平中度敏感; 王高学等(2007)研究表明中间气单胞菌仅对氟苯尼考等高度敏感, 而对硫酸庆大霉素等耐药, 与本文结果有差异。其原因可能在于菌株来源、地理环境及用药情况等不同, 导致不同的耐药结果。为此我们在生产疾病防控时, 严格选择高度敏感药物交替使用, 同时注意使用药物的剂量及疗程, 最大程度上避免病原菌的耐药性产生。

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