宁波沿海陆源排污口放线菌(Actinomycetales sp.)的分布特点*

司开学 夏长革 王朝阳 张迪骏 何 珊 周 君 张红燕韩姣姣 崔晨茜 董丽莎 苏秀榕①

(1. 宁波大学海洋学院 宁波 315211; 2. 吉林省长春市新立城水库管理局 长春 130119)

放线菌是一类具有分枝状菌丝体的革兰阳性菌,是生理活性物质尤其是天然药物的重要来源(刘睿等, 2006; 林亲雄等, 2006; 王海雁等, 2010)。过去的几十年里抗生素及药物筛选一直来源于土壤微生物,其数量及抑菌活性已达到瓶颈。而海洋微生物在极端环境下, 可能会通过调整其次生代谢途径产生具有抑菌作用的生物活性物质。如放线菌产生卤化酶催化的生物活性物质能显著提高其抑菌活性。当今临床和农业上使用的抗生素 75%由放线菌产生(Bérdy, 2005)。由于陆地放线菌已经被长期研究和筛选, 近十多年来, 日本、美国、德国、英国等一些国家和国内的研究机构及制药厂逐步把研究方向转向海洋放线菌。它广泛分布于浅滩、近岸、海洋动植物体内、深海沉积物、海水以及结核矿区、海底冷泉区等。随着海洋经济的推进, 陆源污染物包括工业废水、城镇生活污水、农药和化肥等, 主要通过河川径流入海和沿岸的排污口直排入海, 大气污染还可以通过气体干湿沉降进入海洋。85%以上的海洋污染物都来自于陆源污染, 其成分很复杂, 主要为重金属、难降解有机物和微生物代谢物等, 这也使陆源排污口变成了一个独特的生态圈, 这里生存的大量微生物也就非常具有研究价值。因此, 研究陆源排污口的放线菌多样性意义重大。本文利用454测序技术研究陆源排污口的放线菌的时空分布, 以期为进一步开发利用放线菌、预防和治疗放线菌引起的病害奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取宁波沿海2个重点陆源排污口和8个一般排污口作为采样点(表1)。其中S4、S6、S8和S9为综合排污口, S1、S3、S5、S7和S10为工业排污口, S2为市政排污口(陈丽萍等, 2013)。

分别于2011年3月、5月、8月、10月在排污口处与排污口50m处采集水样5L, 用0.2μm微滤膜过滤后提取DNA(王中华等, 2014)。

表1 宁波沿海10个陆源排污口相关信息Tab.1 Information of ten land-based sewage outlets in Ningbo

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取约2 L的海水, 以0.22μm的微孔滤膜富集微生物, 利用试剂盒提取基因组DNA(美国Omega生物技术公司)(Wanget al, 2014a, b)。

1.2.2 PCR扩增 根据细菌16S rRNA的保守序列,利用Primer Premier 5.0设计扩增引物: 16S F (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3′)和16S R (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3′)。

20μL 扩增反应体系: 10×buffer 2μL, 2 μL MgCl2,2 μL dNTP, 上游引物和下游引物各 25μL, 0.2 μL Taq DNA聚合酶和1 μL DNA模版。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR扩增条件: 94°C预变性4 min, 94°C变性30 s,退火温度从65°C到55°C, 退火30s, 20个循环; 72°C延伸30 s, 94°C变性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30 s,35个循环; 最终72°C延伸10 min(刘兵等, 2009)。

1.2.3 测序与分析 将纯化后的 PCR产物进行454焦磷酸测序(Margulieset al, 2005), 结果用罗氏软件2.5.3进行信号处理分析。根据放线菌在文库中出现的频次数量, 进一步用R For Window 2.15.2、SPSS等进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 排污口放线菌种类

利用 454高通量测序技术, 从宁波沿海10个陆源排污口20个站点4个检测月份80个海水样品, 共成功鉴定出了放线菌目5158个, 酸微菌目481个, 红蝽杆菌目232个, 双栖杆菌目62个, Euzebiales 9个,红色杆菌目 9个, 土壤红杆菌目 8个。也鉴定出 39个科, 83个属和84个种, 有些种是首次发现。

2.2 排污口放线菌的整体分布

由图 1可知, 象山石浦水产加工园区排污口(S4)、北仑三山排污口(S6)和宁海颜公河入海排污口(S9)排污口放线菌门检测频次较高, 分别为 1480、1243和1275次, S9站点50m处检测到放线菌门频次高达831次; 象山石浦水产加工园区排污口(S3)、象山墙头综合排污口(S5)、宁海西店崔家综合排污口(S7)、奉化市下陈排污口(S8)和余姚黄家埠排污口(S10)放线菌门被检频次分别为 522、846、601、536和404次; 象山爵溪西塘排污口(S1)和象山水桶岙垃圾场渗透液排污口(S2站)点检测频次较低, 分别为326次和137次, 其中S2站点排污口处取样检测结果显示被测频次仅为3次, 说明放线菌在该条件下生长受到了一定的抑制作用, 不适合其繁殖生长。总体上看, 距排污口50m以外处检出频次要高于排污口处。

2.3 不同季节放线菌的分布特点

图1 不同月份不同站点放线菌总体分布Fig.1 The distribution of Actinomycetales in different sewage outlets and months

从图2可知, 3月份检出频次为1212/ 16.44%, 5月份检出频次为 3197/ 43.37%, 8月份检出频次为1631/ 22.13%, 10月份检出频次为1330/ 18.04%。从各月份排污口放线菌门频次变化情况来看, 5月份放线菌被检频次最高, 8月份次之, 是放线菌门繁殖最佳的季节; 而3月份和10月份检出频次最低, 故推测放线菌的繁殖数量与季节的变化存在一定的相关性。Allgaier等(2006)在调查德国东北部四大湖泊中放线菌多样性和数量的动态变化时, 发现放线菌数量呈现出有规律的季节性变化, 春季和秋季两个季节达到最大值; Glöckner等(2000)在研究 Gossenkollesee湖泊的放线菌分布时也得出相近的结论:Gossenkollesee湖泊中放线菌数量在4月份和8月份达到顶峰, 这与本研究得出的推论极为相近。然而,也有研究认为冬季是放线菌数量达到最大值的季节(Burkert et al, 2003), 这是由于地理位置的差异和气候的不同造成的。宁波2011年3月份平均气温为15°C,5月份、8月份和10月份平均气温分别为26°C、34°C和23°C。5月份和8月份放线菌较多, 该气温是大多数放线菌生长的最佳气温。尹洪祥(1981)在研究培养温度对某些微生物的生长与培养特性的影响时发现,大多数放线菌, 原放线菌, 分支杆菌等非嗜热性菌株的最适生长温度为 24—37°C(占 98%—100%), 温度升高, 菌株的存活率将逐渐降低。这是由于温度升高会引起微生物呼吸指数的上升, 加速有机碳的矿化,增加了它的有效性, 使微生物活性增强, 生长加快(Hu et al, 1999)。5月份S4和S9放线菌数量较多, 而其它8个站点放线菌数量较少; 8月份S4、S5、S6和S8放线菌数量较多, 而S1、S2、S3等6个站点菌数量较少, 表明影响放线菌生长的因素除了温度以外还有其它因素(Zhang et al, 2004)。

图2 10个排污口处与距排污口50m处四个月份检出放线菌频次情况Fig.2 The distribution of Actinomycetales at 0 and 50 m away from sewage outlets in the four sampling months

2.4 放线菌不同站点的分布特点

从图3可知, 综合排污口(S4, S6, S8和S9)放线菌被检测频次最高, 为4534次, 工业排污口(S1, S3,S5, S7和S10)检测到放线菌的频次次之, 为2699次;S2为市政排污口, 放线菌被检测频次最低, 仅为137次。排污口类型的不同, 放线菌数量呈现出较为显著的差异。综合排污口与市政排污口的放线菌数量差异最为显著, 故推测放线菌被检频次与排污口类型有关。

放线菌大部分属于异养型细菌(Methé et al,1998)。从变化趋势来看, 3月份到10月份大部分排污口放线菌数量呈现出先增长后下降的变化, 尤其是综合排污口表现的更为明显。这表明放线菌的生长环境由适中逐渐转向恶劣, 分析其原因很可能由于3月份工厂大量开工, 排放出大量无机氮, 活性磷酸盐等污染物, 加之气温回升, 为放线菌的生长提供了良好条件。5月份到8月份气温大幅升高, 工厂运行较少,排放废弃物较少, 放线菌营养物质来源受限制, 生长受到抑制。S8、S9属于水产品养殖区, 5月份是这两个站点放线菌暴发期, 而 4月份到6月份属于鱼类疾病高发期, 需注意由放线菌所引起的疾病(Gauthier et al, 2009), 建议相关企业做好疾病防范措施。S7与S10的放线菌数量呈现出的变化与其它站点相反, 主要是由于水体磷和氨氮的含量超标, 导致水体富营养化, 藻类疯狂生长, 水中溶氧量下降, 加之高浓度的氨氮对微生物的生长有一定的抑制作用(赵庆良等,1998), 从而导致放线菌的数量呈现先下降后增长的变化。S2是市政排污口, 排出的主要是象山垃圾场渗透液。这些排污口含有较多的有机物, 氨氮及铬、镍、铝和锰等含量较高(魏云梅等, 2007)。从3月份到10月份, 放线菌数量呈现先下降后升高的变化。这主要是由于随着温度的升高, 氨氮化合物氧化分解加快、耗氧量增加(胡蝶等, 2011), 这使得放线菌的数量大量下降。8月份后, 随着温度的下降, 氨氮物质氧化分解速率降低, 耗氧量减少, 放线菌的繁殖量增加。

图3 不同类型排污口放线菌的分布情况Fig.3 The distribution of Actinomycetales in different types of sewage outlets

2.5 5个工业排污口放线菌的分布特点

陆源排污口污染物入海是造成我国近岸海域环境污染和生态损害的主要原因(Swartz et al, 1985)。S1、S3、S5、S7、S10是宁波市5个工业排污口。工业废弃物(主要含有无机氮, 有机磷, 甚至重金属等污染物)通过陆源排污口排入大海, 对近岸海域生态环境造成严重影响。3月、5月、8月和10月四个月份, 对S1、S3、S5、S7和S10工业排污口放线菌种类检测出16种、17种、21种、38种和24种放线菌。

图4 工业排污口放线菌分布情况的文氏图Fig.4 The Venn diagram of distribution of Actinomycetales in the industrial sewage outlets

表2 5个工业排污口检测出的共同放线菌种类Tab.2 The common Actinomycetales species in five industrial sewage outlets

图4显示, S1与S3、S5、S7、S10有6、9、8和9种共同菌; S3与S5、S7和S10分别检测出共同菌为5、10、8种; S5与 S7和S10检出共同菌分别为13和12种; S7和S10的共同菌为15种。S7与S10检出共同菌种类最多, 推测其适合放线菌生长的营养成分最为接近; 相对于S3和S7站点, S1与S5和S10测出共同菌较多, 推测成分更为接近; 同样可以分析出S3与S7污水成分相近, S5与S7污水的成分相近。结合表2可知, 5个工业排污口的共同菌为: 藤黄微球菌(Micrococcus luteus), 厌盐假诺卡氏菌(Pseudonocardia halophobica), Microbacterium aurum,Candidatus Aquiluna rubra。C. Aquiluna rubra广泛分布于淡水, 部分能在海水中检测到, 属于异养需氧型细菌, 分布于营养丰富的水域(Hahn, 2009; Jung et al,2010), 是宁波陆源排污口优势菌; 在 10个排污口检出总频次为 1367/18.67%, 在 S1检出频次为164/2.24%, 在 S3、S5、S7和 S10检出频次分别为15/0.21%、38/0.52%、30/0.41%和 48/0.66%, 表明相对于 S3、S5、S7和 S10来说, S1的环境更适合 C.Aquiluna. rubra的生长。产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)是人体肠道中数量最高, 也是肠道微生物致病率最高的的厌氧革兰氏阳性菌, 主要在粪源污染物中分离得到(Kageyama et al, 2000)。S1和S7两个站点检出26/0.36%产气柯林斯菌(C. aerofaciens),推测S1和S7附近有粪源污染物。5个工业排污口中,S7独自检出了短双歧杆菌(Bifidobacterium breve), 长双歧杆菌(B. longum), 两岐双岐杆菌(B. bifidum)。双歧杆菌属于严格厌氧微生物, 存在于人体肠道中, 其中短双歧杆菌只存在于婴儿肠道中, 这进一步证明了S7存在人类粪源污染物。皱孢链霉菌(Streptomyces scabrisporus)和硫藤黄链霉菌(S. thioluteus)隶属于放线菌门, 放线菌纲, 放线菌目, 链霉菌科, 链霉菌属,在S5处独自检出。该排污口评价近岸海域综合环境质量为差, 生物质量类别为第二类海洋生物, 其主要污染物为铅, 石油烃等, 生物质量综合等级为严重污染。有研究表明, 链霉菌属有促进对石油烃的降解作用(刘海军等, 2014)。放线菌在含重金属的环境中生存表现了一定的优势。研究发现培养初期的放线菌对镉的耐受性很强, 高浓度的镉可能刺激了放线菌的大量繁殖(陈文清, 2009), 而链霉菌是其中的优势菌群(Amoroso et al, 1998)。这是因为放线菌可以通过改变重金属的价态来影响金属的生态毒性, 它产生的具有絮凝活性的代谢物, 分泌到细胞外能使水中的胶体悬浮物互相凝聚沉淀, 从而达到去除重金属离子的目的(Nies, 1999)。

3 结论

利用 454高通量测序平台, 从宁波10个陆源排污口20个取样站点4个月份, 鉴定出了放线菌的83个属, 84个种。Candidatus Aquiluna rubra在5个工业排污口广泛分布和大量繁殖, S1和S7有难培养的厌氧产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)的检出, 尤其是 S7还检出了双歧杆菌。对此, 相关企业应及时排查人类粪源污染物源头。S5处独自检出皱孢链霉菌(Streptomyces scabrisporus)和硫藤黄链霉菌(S.thioluteus), 反映了石油降解物和重金属带来的环境压力, 应加强监测和防治。

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