百里香酚与苯醚甲环唑对芒果蒂腐病菌的联合毒力

叶火春+周颖+张静+闫超+冯岗

摘 要 为明确百里香酚与苯醚甲环唑混配药剂对芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat.）的毒力增效作用，采用菌丝生长速率法测定百里香酚、苯醚甲环唑及其混配药剂对芒果蒂腐病菌的毒力，结合Horsfall法筛选混配药剂的增效比例，以孙云沛共毒系数法评价其联合毒力。结果显示，百里香酚与苯醚甲环唑配比为8∶2、7∶3和6∶4时，对抑制芒果蒂腐病菌菌丝生长表现为增效作用，其中以7∶3时增效最明显，毒性比率TR值为1.26；共毒系数法显示，百里香酚与苯醚甲环唑以7∶3混配时的EC50值为16.53 μg/mL，CTC值达175.25，增效显著。百里香酚与苯醚甲环唑混剂抑制芒果蒂腐病菌菌丝生长的最佳增效配比为7∶3。

关键词 百里香酚 ；苯醚甲环唑 ；可可球二孢菌 ；混配 ；增效作用

分类号 S482.2

Synergistic Toxicity of Thymol and Difenoconazole on Mango Pathogenic

Fungi Botryodiplodia theobroma

YE Huochun ZHOU Ying ZHANG Jing YAN Chao FENG Gang

（1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101；

2 Heilongjiang Bayi Agriculture University， Daqing， Helongjiang 163319）

Abstract The aim of this study was to investigate the synergistic effect of thymol and difenoconazole mixed fungicides on Botryodiplodia theobroma Pat； The toxicity to B. theobroma Pat of thymol， difenoconazole and their mixture was determined by mycelium growth rate test； Horsfall test design and Sun-Johnson method were used to evaluate the synergistic effect of the fungicides against B. theobroma Pat. The result showed that the mixtures of thymol and difenoconazole at the ratio of 8∶2， 7∶3 and 6∶4 exhibited synergistic internation against the mycelial growth of B. theobroma Pat， and the most obvios synergistic effect at the ratio of 7∶3 with toxicity ratio（TR）of 1.26.The result of sun-Johson showed that the EC50 value of the 7∶3 mixture was 16.53 μg/mL， and the mixture indicate evident synergistic effect with CTC value of 175.25. The mixture of thymol and difenoconazole at the ratio of 7∶3 is the optimal synergistic proportion.

Keywords thymol ； difenoconazole ； Botryodiplodia theobroma Pat. ； mixture ； synergistic effect.

近年来，以苯醚甲环唑防控芒果蒂腐病取得良好的效果，然而由于作用靶标位点单一，也将面临病菌抗药性产生的风险，为了减缓苯醚甲环唑抗药性，利用药剂合理混配，实施药剂多作用位点防治是延缓药剂抗药性有效途径之一。百里香酚自2013年被批准作为植物保护产品后，备受人们关注[1]。本研究尝试将其与苯醚甲环唑混配，旨在为开发基于百里香酚的新型防治芒果蒂腐病的速效混剂以及植物病原菌对苯醚甲环唑抗药性治理提供依据。

芒果蒂腐病是一种普遍发生且危害严重的世界性芒果病害，该病于幼果期潜伏侵染，于芒果后熟期发病，迅速造成果肉变软腐烂，病果率达10%～40%[2]。研究表明，海南芒果蒂腐病主要由可可球二孢菌（Botryodiplodia theobroma Pat.）引起，该病菌还可为害木瓜、可可、木薯等多种作物和林木，以为害果实和茎部为主，还可侵染叶部和根部[3-4]。化学防治是控制该病害的主要方法，然而频繁单一地使用化学杀菌剂容易导致病原菌抗药性的产生，如该病原菌对多菌灵、苯莱特、甲基硫菌灵、烯唑醇和嘧菌酯均表现出抗药性，造成防治效果降低和药剂的大量使用[5]。

苯醚甲环唑是一种广谱、高效、低毒的三唑类杀菌剂，广泛应用于果树、蔬菜等作物，有效防治叶斑病、黑星病、白粉病、锈病等多种作物病害[6]。近年来，该药已常用于防治芒果采前、采后病害[7]。苯醚甲环唑属甾醇脱甲基化抑制剂（DMI），作用位点单一，长期频繁使用，抗药性风险不容忽视[8]。苯醚甲环唑相比其他三唑类杀菌剂抗性水平较低，但最近几年陆续报道了该药在苹果腐烂病、黑星病及小麦赤霉病上出现抗药性，并呈上升趋势[8-11]。芒果蒂腐病菌目前尚未对苯醚甲环唑出现抗药性，但该病菌已对多种高效、选择性的杀菌剂表现出了抗药性。为减缓芒果蒂腐病菌抗药性产生、延长有效期和提高药效，苯醚甲环唑与不同作用机制的杀菌剂混合使用有必要进行。有研究报道，苯醚甲环唑与吡唑醚菌酯混配对马铃薯早疫病、花生褐斑病及山药炭疽病的防治均有增效作用，与咯菌腈混配对防治马铃薯早疫病也表现了增效作用，并提高产量[6，12-14]。

百里香酚（Thymol，5-甲基-2-异丙基酚）又名麝香草酚，为百里香等唇形科植物精油的主要成分之一，具有驱虫，抗氧化和抗菌活性。近年研究表明，百里香酚对芒果蒂腐病等多种植物病原菌具有良好的抗菌活性[15-16]，可通过抑制端粒酶或者ATPase活性而抑制真菌生长[17-18]。

目前百里香酚作为杀菌剂的商品制剂还很罕见，如何利用好其作为植保产品，成为人们关切的问题。同时国内尚未报道预防芒果蒂腐病菌对苯醚甲环唑抗药性产生的混剂，因此本研究尝试将百里香酚与苯醚甲环唑混配，以期获得百里香酚与苯醚甲环唑增效混配配方。为明确百里香酚与苯醚甲环唑混剂是否对芒果蒂腐病菌增效，本研究测定了百里香酚与苯醚甲环唑混剂对芒果蒂腐病菌联合毒力以及增效系数。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

芒果蒂腐病菌（可可球二孢菌）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所采后病理及保鲜实验室提供，斜面培养并保存，转接至平板培养2 d备用。

1.1.2 药剂

百里香酚（≥99.0%）购自国药集团化学试剂有限公司，95%苯醚甲环唑原药购自山东潍坊瑞丰化工有限公司，上述两种药剂分别用丙酮配制为5.00×104 mg/L和1.00×104 mg/L的母液备用。

1.2 方法

1.2.1 百里香酚和苯醚甲环唑单剂对芒果蒂腐病菌的毒力测定

毒力测定采用菌丝生长速率法[19]。在预试的基础上，将百里香酚母液用0.1%吐温-80无菌水溶液配制成200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 mg/L的含药PDA平板，苯醚甲环唑母液用0.1%吐温-80无菌水溶液配制成0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 2 mg/L的PDA平板，在芒果蒂腐病菌培养2 d的菌落边缘制取菌块（直径为0.40 cm），置于含药平板中央，于28℃培养，每个处理重复3次，以不加药剂的平板为对照。测量处理后菌落直径，并计算抑制率及抑制中浓度EC50。

1.2.2 百里香酚和苯醚甲环唑混配最佳比例筛选

采用Horsfall[20]法设计混配比例，生物测定同1.2.1。将百里香酚与苯醚甲环唑两单剂分别以0.1%吐温-80无菌水溶液配制EC50药液，以其体积比为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 、9∶1、0∶10设置11种比例混配处理，以不加药剂的处理为对照，重复3次，计算各混配药剂的抑制率及毒性比率TR（实际抑制率/理论抑制率）。当TR值大于1为增效作用；等于1左右为相加作用；若小于1为拮抗作用，以TR最高者为最佳配比。

1.2.3 混配药剂共毒系数测定

在确定最佳配比的基础上，设置5个浓度梯度，重复3次，以不加药剂为空白对照，生物活性测定同1.2.1，计算混配药剂的EC50。根据上述测定基础，采用孙云沛法计算混配药剂共毒系数（CTC），以CTC值大小评价混配药剂的增效作用。若CTC值大于120，为增效作用；若在80～100之间为相加作用；而明显小于100（80以下）时，则为拮抗作用[21]。

公式中A、B药剂为混配的单剂， A%和B%分别为A、B单剂在混合药剂中的含量；标准药剂以其中一种单剂进行计算。

2 结果与分析

2.1 百里香酚与苯醚甲环唑毒力测定

百里香酚与苯醚甲环唑对芒果蒂腐病菌毒力结果表明，两种单剂均有较高毒力，而苯醚甲环唑毒力明显高于百里香酚，二者EC50值分别为0.14和29.03 μg/mL，见表1。

2.2 混配杀菌剂毒性比率测定

百里香酚和苯醚甲环唑分别配制成30.0和0.150 μg/mL两种单剂药液，按其体积比混配的活性结果表明，两者以8∶2、7∶3和6∶4等3种配比的毒性比率大于1，呈现增效作用，其中以配比为7：3的毒性比率最高，达到了1.26，其增效作用最明显；其他配比均不超过1，未表现出增效作用，如表2。

2.3 混配杀菌剂共毒系数测定

百里香酚与苯醚甲环唑在配比7∶3时，对芒果蒂腐病菌的EC50值为16.53 μg/mL，毒力回归方程为Y=2.476 3+2.071 6X，共毒系数为175.25，CTC值大于120，表现为增效作用（图1），结果与Horsfall法测定相符。

3 结论与讨论

3.1 结论

百里香酚与苯醚甲环唑对芒果蒂腐病菌生长均具有良好抑制活性，二者按EC50值剂量混配的最佳增效配比为7∶3，该配比混合的联合毒力EC50值为16.53 μg/mL，共毒系数达175.25，增效显著。

3.2 讨论

本试验药剂混配采用Horsfall法和孙云沛共毒系数法先后进行定性和定量筛选，具有覆盖面宽、成功率高和减少工作量等优点，该筛选方法是一种较佳室内试验设计方案[20]，倍受科研人员青睐。叶正和等[22]采用该筛选方法在草莓白粉病杀菌剂混配测定时取得良好筛选结果，张胡焕等[23]在该方法基础上筛选了防治芒果炭疽病菌增效药剂配方。

植物源活性物质与化学农药增效混配，提高了植物源活性物质的防治效果，延缓化学农药抗性产生、减少农药用量，提高对环境安全性，减少农产品质量问题。植物源活性物质与化学农药合理混配，扩展了植物源物质农药活性的应用空间，同时也延长了化学农药的使用年限。植物源茶皂素与代森锰锌混配配比为3∶7时对辣椒炭疽病菌防效优于这两种单剂[24]，乙蒜素与壬菌铜按一定配比混配提高了对番茄灰霉病的防效[25]，小檗碱加入微量多菌灵即可增强其对桃褐腐病的抑制活性[26]。本研究表明，百里香酚与苯醚甲环唑以配比为7∶3时，对芒果蒂腐病菌具有一定的增效作用，这结果为百里香酚和苯醚甲环唑混配制剂的开发提供理论依据。本研究只在室内筛选药剂增效混配组合，其田间药效，作用方式及增效机理等还亟待一步研究。

百里香酚存在于多种植物精油中，提取工艺简易，其化学结构也不复杂，易于合成，这就为百里香酚原药的大规模生产创造了有利的条件[15]。因此，百里香酚来源丰富，具有广阔的综合利用开发前景。源于植物产物的百里香酚在自然界中易降解，对环境安全，寻找与其混配具有互作增效的杀菌剂，并结合相应的合理组合、室内生物测定与田间试验等方法，筛选出安全、经济和高效的百里香酚杀菌制剂，从而拓展百里香酚做为植物保护产品的应用范围，同时提高化学杀菌剂使用寿命，因此开展百里香酚及其混剂的商品化制剂研究具有重要意义。

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