热原及其检测方法的研究进展

郭春雪

摘要：目的：对热原物质及其检测方法进行阐述。方法：通过对热原物质本质的分析，总结药典要求的家兔热原检测法和内毒素检测法的优缺点，并根据两种常用检测方法使用存在的局限性，简要介绍新的热原检测法-细胞检测法。结果与结论：家兔法和内毒素检测法的影响因素限制了检测方法的使用范围，新的检测方法拓宽了检测范围，实现标准化，但仍需要进一步验证和论证，故需要进一步完善热原检测方法，实现药品的使用安全。

关键词：热原物质 热原检测方法 研究

中图分类号：R286 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）02（b）-0000-00

热原在韦伯斯特字典中曾被定义为致热剂，是指由微生物进入血液循环系统时引起恒温动物体温异常升高的致热性物质，包括内毒素，革兰氏阳性细胞碎片、真菌和病毒等。目前普遍认为热原所引起的发热反应主要是由革兰氏阴性细菌所产生的内毒素（脂多糖）引起的，因其存在的普遍性、稳定性和相对的致热性，内毒素的检测又可以保护人和动物避免发生有害反应（败血症），故FDA和USP指南要求所有非经肠道药品和医疗器械的终产品都要做内毒素检测，使产品不因内毒素而效力降低[1]，但是严格意义上说，不是每一种热原都具有脂多糖结构，所以，随着生物技术的发展，热原的检测方法已经从动物试验、定性试验发展到定量试验，也已经从广泛应用鲎血细胞检测发展到利用人源细胞检测。

1 热原的定义

在 15至16世纪，实验医学界充满着关于静脉注射疗法的诸多报道，起因于许多病人经静脉注射后都伴随着发热反应，直到18世纪丹麦生物学家panum的研究中断定，引起这种发热反应其实是一种对热稳定，溶于水但不溶于乙醇，由活的细菌中由来的一类物质，微量注射后就可引起高热反应，1923年至1925年美国科学家Florence Seibert证实了所有的注射发热反应都是由可过滤、热稳定的革兰氏阴性细菌产生的物质造成的，随后Rademaker进一步证实了seibert的发现，并共同确立了使用家兔检测注射剂及稳定生产静脉注射液的方法。细菌内毒素革兰氏阴性细菌细胞外壁层上的特有结构，在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时才表现出毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖，其水溶性好，耐热性稳定，核酸多糖的高分子结构也不易被破坏。在机体水平上的活性主要表现为发热性、致死毒性和血小板减少等。 热原即发热性物质，广义上说是所有引起恒温动物体温异常升高物质的总称，除内毒素引起发热外，其实还包括病毒，干扰素以及其他种种发热物质，所以，所有可以引起热原反应的物质都是热原检测的范畴

2 热原的检测方法

2.1 家兔热原检查

家兔热原检查法是1942年首次被收载于《美国药典》12版，半个世纪以来也一直作为法定热原检查的权威标准为各国药典所采用，该方法是将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以此判定供试品所含热原的限度是否符合规定。该方法优点是家兔与人类所引起的发热反应的最小内素素几乎相当，并且家兔还具有繁殖容易，使用、注射方便等特点，该方法不但能检测出细菌内毒素的致热原，也能检测出非细菌内毒的致热原[2]，并且适用于检查较多种类的热原物质，仍是目前我国药品和生物制品质量评价中常用的方法。同时该方法也受到多种因素影响检测结果，家兔体温的稳定性和均一性是家兔检测热原的一个重要的因素，但是由于受到饲养环境、实验环境、家兔个体差异和种属差异的影响，家兔的体温很维持在所需要的范围内，此外，使用活体动物费用较高，重复性差，应用范围有限，也不符合3R原则[即减少（reduction）、替代（replace）和优化（refinement） [3]，该方法本身又是一种不能定量的限度试验，因此建立一种准确、规范的定量检测热原方法势在必行。

2.2 细菌内毒素检测法

细菌内毒素检测法（Bacterial Endotoxin Test，BET）是由美国科学家Drs.Frederick B.Bang和Jack Levin创建的，于1980年被正式收载于《美国药典》20版，也被称作鲎试剂检测法，鲎试剂是使用美洲鲎的阿米巴细胞的溶胞物质制备的，因此取名为Llus Amebocyte Lysate（LAL），BET是基于鲎试剂与内毒素发生特异性反应，形成凝胶或显色来判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，是控制药品质量的一项重要检测项目，该方法的优点是操作简单，结果快速可靠，灵敏度较兔法高10倍以上，试验成本低廉，最重要的是可以利用细菌内毒素标准品（Endotoxin Standard）对供试品进行定量或半定量检测，应用范围广泛。但是该方法最大的缺点是只能对革兰氏阴性细菌产生的细菌内毒素进行检测，此外，由于鲎资源有限，鲎试剂又易受外界条件干扰，如PH值，温度等，发生假阳性的几率较高，所以目前还不能完全取代家兔检测法。

2.3 细胞检测法

随着基因治疗产品、新生物材料及中药注射剂等新制品的不断增加，家兔热原检测法和BET法本身存在的局限性，以及公众对动物保护的呼声日益高涨，因此研究新的热原检测法是一种趋势。研究发现外源性发热物质能刺激免疫细胞分泌一些与发热有关的细胞因子，通过酶联免疫法对相关细胞因子进行定量检测就能确定外源性热原的存在与否及存在含量[4]，这是进行新方法研究的依据，根据细胞的不同来源和种类可分为三大类：人来源血液或細胞法、其他动物来源血液或细胞法、细胞模型。与传统方法相比较，新的检测方法具有BET高灵敏度和家兔法宽检测谱，检测费用更加低廉，更能反映人体对不同种热原的反应，填补了传统方法的空白，更大程度的保证了人体临床用药的安全。尽管目前已经有7中新检测方法得到欧洲权威机构，英国国家生物制品检定所得正式验证和推荐，但是仍有很多不足之处，如对细胞产生毒副作用或增值抑制作用的药物，对细胞因子有干扰作用的制品等，因此，新热原检测方法还需要进一步的完善。

总之，随着细胞生物学技术和分子生物学技术的日益发展和应用，利用细胞检测法对供试品进行热原检测是国际研究热原物质的必然趋势，新检测方法的进一步论证与家兔法、细菌内毒素法的逐步改善必会更加完善热原的检测方法，使其更加准确。

参考文献

[1]秦媛媛，吴彦霖，刘倩，等. 三类体外热原检测方法的研究进展[J]. 中国药事，2012，26（5） ：507-512

[2 ]沈娟，武向锋，王文俊，等. 家兔细菌内毒素致热的灵敏度变化研究[J]. 解放军药学学报，2009，25（5）： 441-443.

[3 ]Thomas Hartung，Ingeborg Asberge，Susanne Berthold，etal. Novel pyrogen tests based on the human fever reaction the report and recommendations of ecvam workshop[J]. Alter Lab Animals，2001，（29）：99-123.

[4]谭德讲，任珺，杜颖，等.热原和热原检测方法的研究进展[J].药物分析杂志，2004，24（6）：653-659