重金属铅铬对星豹蛛体内几种重要酶活性的影响

重金属铅铬对星豹蛛体内几种重要酶活性的影响

李萨丽1,李娜1,张晓阳1,李锐1*,李生才1,洪坚平2

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801; 2.山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801)

摘要：为了探讨重金属铅、铬胁迫对害虫天敌星豹蛛Pardosa astrigera L.Koch成蛛体内几种重要酶活性的影响，采取人工添毒法用不同浓度的重金属Pb2+、Cr6+溶液饲喂星豹蛛成蛛5 d，10 d，15 d，20 d，25 d，研究不同浓度，不同时间段铅、铬胁迫下的星豹蛛体内过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽-S-转移酶GST的酶活性变化及其相关性。结果显示，铅、铬胁迫下，星豹蛛体内的过氧化氢酶CAT活性变化趋势大致相同，但变化程度不同；超氧化物歧化酶SOD的活力大小均高于对照，且两种重金属作用下的变化趋势不同，铅(200，400，1 000 mg·L-1)胁迫下SOD活性在10 d和20 d出现两个高峰值，分别是对照的3.112 7、4.178 5、2.992 4和1.175 8、1.132 2、1.249 3倍，铬(0.25，0.5，2.5 mg·L-1)胁迫下在20 d达到高峰值，为对照的1.141 6、1.431 4、1.238 5倍；谷胱甘肽-S-转移酶GST的酶活性在铅胁迫下均小于对照，铬胁迫下只在低浓度(0.25，0.5 mg·L-1)处理下作用20 d显著高于对照(P<0.05)。可见，重金属铅、铬胁迫下，总体上是抑制了星豹蛛体内GST的活力，激活了CAT和SOD的酶活力，从而达到保护自身的作用。而且这三种酶活力的变化与重金属的种类、剂量和作用时间密切相关。

关键词：星豹蛛；铅；铬；酶活性

收稿日期：2015-06-10修回日期：2015-08-07

作者简介：李萨丽(1990-)，女(汉)，山西运城人，硕士研究生，研究方向：昆虫生态与综合治理

通讯作者：*李锐，副教授，硕士生导师。Tel：13994576619；E-mail：sxaulr@126.com

基金项目：中国博士后基金(112125)；山西省科技攻关项目(20130311011-5,20120311013-)；山西省留学基金项目(2013-重点6)

中图分类号：S476.2文献标识码：A

Effects of Plumbum and Chromium Stressed on Activities of Some Enzymes in Wolf Spider, Pardosa astrigera (Araneae:Lycosidae)

Li Sali1, Li Na1, Zhang Xiaoyang1, Li Rui1*, Li Shengcai1, Hong Jianping2

(1.CollegeofAgronomy,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China； 2.CollegeofResourcesandEnvironment,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:In order to clarify the enzyme reaction of plumbum and chromium stressed in pest enemy Pardosa astrigera. Feeding Pardosa astrigera 5 d, 10 d, 15 d, 20 d, 25 d on different concentration of plumbum and chromium which were sexual maturity from field collected. The activities of catalase and superoxide dismutase and glutathione-S-transferase in the Pardosa astrigera after treated with plumbum and chromium were evaluated in different concentrations and different times. The results showed that the activities of catalase were roughly the same change trend under two heavy metal stressed, but they have different degree of change.The superoxide dismutase activities were higher than control and the change trend under the action of two kinds of heavy metal was different, superoxide dismutase activity of plumbum stressed on the 10 d and 20 d appeared two peak values, respectively was comparison of 3.112 7, 4.178 5, 2.992 4 and 1.175 8, 1.132 2, 1.249 3 fold. The other appeared one peak value at 20 d, being 1.141 6, 1.431 4, 1.238 5-fold higher than that of the water control, respectively. The activities of glutathione-S-transferase under the stress of plumbum were less than control, only in low chromium stress concentration treatment of 20 d was significantly higher than control (P<0.05). It was obvious that the activities of glutathione-S-transferase were inhibited, and the activities of catalase and superoxide dismutase were enhanced in the adult of Pardosa astrigera being treated with plumbum and chromium, thus the important natural enemy can protect themselves. And enzyme activity changes associated with heavy metal species, dose,and duration.

Key words:Pardosaastrigera; Plumbum; Chromium; Enzyme activity

星豹蛛(PardosaastrigeraL.Koch)属蛛形纲(Arachnida)狼蛛科(Lycosidae)豹蛛属(Pardosa)，是农林害虫的主要捕食性天敌，具有数量大、生态多样、分布广泛等特点，在害虫生物防治中具有极其重要的作用，是一种比较有利用价值的天敌[1～3]。

近年来重金属源农药污染严重，不仅污染生态环境，还可以通过食物链转移和积累[4]，对害虫天敌产生毒害作用。研究发现，星豹蛛种群数量逐渐下降，造成农田环境严重恶化，作为生防资源，应该受到保护。到目前为止，铅(Pb2+)、铬(Cr6+)已被列为主要的农业源重金属环境污染物[5]，在生物体内具有蓄积性，并在国内多种水生和陆生的动植物体内检测到[6]。

国内外学者就重金属对包括无脊椎动物在内的动物机体结构及生理生化效应等方面的影响做了较多的研究工作[7]。有关重金属污染对昆虫影响的文献逐渐增多，涉及对双翅目、鳞翅目、鞘翅目和直翅目昆虫等抗氧化酶的影响[8～12]。研究结果显示，重金属胁迫与其能够诱导生物体产生氧化损伤密切相关，在长期的进化过程中，生物体内也形成了一整套高效的抗御自由基损伤作用的抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、过氧化氢酶(catalase, CAT) 和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)等[13]。但有关重金属对害虫天敌影响的研究报道较少。

本研究采用人工添毒法，测定铅、铬胁迫对害虫天敌星豹蛛体内 SOD，CAT和 GST酶活性的影响，为进一步保护与利用星豹蛛进行有害生物综合防治以及环境中重金属污染监测提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料

星豹蛛采自山西农业大学小麦试验田(东经111°32′，北纬37°26′，海拔781.9 m)，未施过任何药剂。带回实验室单头置于试管内(内径1.5 cm，长8 cm)，放入人工气候箱内饲养(L∶D=16∶8，RH=70%)，湿棉球保湿，每次喂果蝇6头，每2 d喂一次，试验前饥饿处理24 h待用。

1.2重金属胁迫和样品制备

以硝酸铅Pb(NO3)2、铬酸钾K2CrO4作为Pb2+，Cr6+源，用蒸馏水将Pb2+浓度配置为1 000 mg·L-1、400 mg·L-1、200 mg·L-1三个浓度；Cr6+的浓度为2.50 mg·L-1、0.50 mg·L-1、0.25 mg·L-1三个浓度，清水作对照。采用人工添毒法，每个浓度处理30头性成熟的星豹蛛，每2 d注射一次配好的药液0.5 mL于试管内的棉球上供星豹蛛饮用。处理5 d、10 d、15 d、20 d、25 d后各取五头称重冻于-70 ℃冰箱备用。

1.3酶活性的测定

各处理组的星豹蛛按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水于高速冷冻离心机下2 500 r·min-1，离心10 min，取上清液作为酶源。根据试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明加入相应试剂，用Spectra Max M5酶标仪(美国Molecular Devices公司)测吸光度值，计算酶活性。

1.3.1过氧化氢酶(CAT)活力测定

主要原理：过氧化氢酶分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，用酶标仪405 nm处测定其生成量，以每毫克蛋白每秒分解1 μmol H2O2的量为一个活力单位(U)，可计算出CAT的活力。

1.3.2超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

1.3.3谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活力测定

主要原理：以谷胱甘肽作底物，经GST作用，与还原型谷胱甘肽(GSH)反应可生成黄色硫醇尿酸衍生物，其活力以催化GSH氧化的反应速度及单位时间内GSH减少的量来表示，37 ℃水浴中反应10 min，用酶标仪340 nm处测定OD值。

1.3.4蛋白含量测定

参考Bradford(1976)法，采用考马斯亮蓝G250测定酶液中可溶性蛋白含量。以牛血清蛋白制作标准曲线y = 0.003 1x+0.545 3 (R2= 0.996 0，p<0.01)，其中x为蛋白含量(μg)，y为OD值。

具体操作步骤：按CAT、SOD和GST试剂盒说明进行。(CAT、SOD和GST试剂盒购自南京建成生物工程研究所)

1.4数据处理方法

实验结果以平均值±标准误表示，采用SPSS 16.0软件进行方差分析与多重比较。

2结果与分析

2.1铅和铬对星豹蛛CAT活性的影响

2.1.1铅胁迫星豹蛛CAT活性的影响

铅胁迫星豹蛛成蛛后其体内CAT活性变化如表1所示，酶活性变化趋势为先上升后下降(见图1)。清水对照组的CAT活性变化较大，在不同的处理时间内差异显著(P<0.05)，处理15 d CAT活性最高，20～25 d降到最低。用铅处理后，酶活性最高点出现在200 mg·L-1作用下15 d，其活力为(2 361.98±80.89) U·mg-1prot，为对照的1.467 4倍；最低点出现在1 000 mg·L-1作用下25 d，其活力为(560.76±4.77) U·mg-1prot，为对照的0.847 1倍。在铅胁迫5 d内，各处理组的CAT活性均小于对照，分别为对照的0.975 1、0.964 6、0.893 9倍，说明铅处理后CAT活性被抑制。10～15 d，各处理组的CAT活性都明显上升，在15 d达到最大，分别为对照的1.467 4、1.315 7、1.201 2倍。20 d后随着铅胁迫时间的延长，各处理组的CAT活性又开始下降，25 d后降到最低。在铅胁迫的25 d内，低浓度处理的星豹蛛体内CAT酶活性较高，而高浓度处理下活性有所下降，原因可能是低浓度的铅溶剂可刺激星豹蛛体内保护酶系，而高剂量作用下抑制保护酶系，造成氧自由基在体内的聚集，从而导致虫体死亡。

表1　铅处理对星豹蛛体内过氧化氢酶活性/U·mg -1 prot的影响

注:表中数据为平均值±标准误；同行不同大写字母表示差异显著，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05,新复极差法)；下同。

Notes: The data in the table are mean±SE. Significant difference was found in capital letters in the same row, lowercase letters in the same column are different significantly by Duncan′s multiple range test(P<0.05.The same below.

图1　铅处理对星豹蛛CAT活性的影响 Fig.1　Effect of plumbum on CAT activity in Pardosa astrigera

2.1.2铬胁迫星豹蛛CAT活性的影响

铬胁迫星豹蛛成蛛后体内CAT活性变化见表2，处理组与对照组在不同时间段的变化趋势相似，都是在15 d上升到峰值，随后显著下降(P<0.05)，25 d降到最低(见图2)。铬处理组内CAT活性最高点出现在0.5 mg·L-1作用15 d，值为(2 112.54±76.98) U·mg-1prot，是对照的1.312 5倍；最低点出现在2.5 mg·L-1作用25 d，值为(544.52±6.06) U·mg-1prot，是对照的0.822 6倍。铬处理5 dCAT活性较低，5～20 dCAT活性均大于对照，说明铬处理后短时间内激活了星豹蛛体内的CAT酶活性，20～25 dCAT活性显著下降(p<0.05)，结果表明星豹蛛体内CAT活性与重金属铬饲喂存在显著的时间效应关系。

2.2铅和铬对星豹蛛SOD活性的影响

2.2.1铅胁迫对星豹蛛SOD活性的影响

铅处理星豹蛛成蛛后其体内SOD活性的测定

表2　铬处理对星豹蛛体内过氧化氢酶活性/U·mg -1 prot-的影响

图2　铬处理对星豹蛛CAT活性的影响 Fig.2　Effect of chromium on CAT activity in Pardosa astrigera

结果如表3所示，对照组SOD活性变化较大，在不同处理时间内差异显著(P<0.05)，其中在5～

表3　铅处理对星豹蛛体内超氧化物歧化酶活性/U·mg -1 prot的影响

2.2.2铬胁迫对星豹蛛SOD活性的影响

铬处理星豹蛛成蛛后SOD活性测定结果见表4，各处理组酶活力均高于对照，最大值出现在0.5 mg·L-1作用20 d，值为(336.31±41.85) U·mg-1prot，最小值出现在2.50 mg·L-1作用10 d，值为(105.31±0.66) U·mg-1prot。铬处理组酶活性随着时间的变化呈波浪式变化(见图4)，在处理10 d时，SOD活性降到一个低峰，各处理组酶活性分别是对照的2.067 1、1.915 5、1.888 6倍；处理20 d，SOD活性又上升到一个峰值，各处理组酶活性分别是对照的1.141 6、1.431 4、1.238 5倍。铬处理25 d，不同浓度处理间差异显著(p<0.05)分别为对照的6.322 7、10.698 0、8.279 8倍。结果显示，铬处理星豹蛛成蛛后激活了其体内的SOD活性。

表4　铬处理对星豹蛛体内超氧化物歧化酶活性/U·mg -1 prot的影响

图3　铅处理对星豹蛛SOD活性的影响 Fig.3　Effect of plumbum on SOD activity in Pardosa astrigera

图4　铬处理对星豹蛛SOD活性的影响 Fig.4　Effect of chromium on SOD activity in Pardosa astrigera

2.3铅和铬对星豹蛛GST活性的影响

2.3.1铅胁迫对星豹蛛GST的影响

铅处理星豹蛛成蛛，其体内GST活性变化如表5，对照组星豹蛛的GST酶活力在不同处理时间内差异显著(P<0.05)，其中20 d活性最高，10 d活性最低。铅处理后，最大值出现在200 mg·L-1作用5 d，值为(3 450.67±7.90) U·mg-1prot；最小值出现在200 mg·L-1作用10 d，值为(748.92±4.75) U·mg-1prot。各处理组的酶活变化趋势不同，低浓度处理下，星豹蛛体内GST活性变化与对照相似，即先显著下降后又显著上升，最后再显著下降(p<0.05)；400 mg·L-1处理下，谷胱甘肽-S-转移酶的活性在10 d，20 d出现两个低峰值，其值为(1 057.71±9.02) U·mg-1prot和(1 060.71±5.22) U·mg-1prot；1 000 mg·L-1处理下，谷胱甘肽-S-转移酶的活性在10 d，20 d出现两个高峰值，其值为(1 687.77±54.67) U·mg-1prot和(2 293.78±21.00) U·mg-1prot(见图5)。虽然各处理组都出现峰值但是各处理组的GST活性均小于对照，说明铅胁迫对星豹蛛体内GST的激活作用较弱。

图5　铅处理对星豹蛛GST活性的影响 Fig.5　Effect of plumbum on GST activity in Pardosa astrigera

表5　铅处理对星豹蛛体内谷胱甘肽-S-转移酶活性/U·mg -1 prot的影响

2.3.2铬胁迫对星豹蛛GST的影响

铬处理星豹蛛成蛛后其体内GST活性见表6，各处理组GST活性最大值出现在0.25 mg·L-1作用20 d，值为(7 884.67±62.08) U·mg-1prot，为对照的1.386 9倍；最小值出现在0.50 mg·L-1作用25 d，值为(478.75±4.14) U·mg-1prot，仅为对照的0.225 0倍。处理组的活性变化趋势与对照相似，5～10 d酶活性受到抑制，10 d降到低峰，分别为对照的1.245 6、0.844 5、1.075 3倍；10～20 d酶活性显著上升(P<0.05)20 d升到高峰，分别为对照的1.386 9、1.331 6、0.824 1倍。同一时间处理，不同浓度下差异显著(P<0.05)。低浓度的铬处理，酶活力在20 d显著高于对照，说明在铬胁迫星豹蛛过程中，其体内的GST酶起到了解毒作用，保护机体免受外来毒物的影响。

表6　铬处理对星豹蛛体内谷胱甘肽-S-转移酶活性/U·mg -1 prot的影响

图6　铬处理对星豹蛛GST活性的影响 Fig.6　Effect of chromium on GST activity in Pardosa astrigera

3讨论

外源毒物进入星豹蛛体内需要经过氧化、还原、水解等多种方式降解，然后将代谢物排出体外，这些过程都需要由一系列酶系催化完成，抗氧化防御即是其中之一，如果其抗氧化防御机制被打破，自由基的产生就会增多，从而引起氧化应激损伤。超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和谷胱甘肽-S-转移酶GST是重要的抗氧化酶系。本文分析了铅和铬处理后对上述三种酶的影响。

研究结果显示，重金属铅、铬处理激活了星豹蛛体内CAT活性，但是随时间的延长CAT活性下降，且在高浓度的重金属胁迫下可能抑制保护酶，造成氧自由基在体内的聚集，从而导致虫体死亡。而且铅与铬胁迫下，CAT活性变化趋势虽相同但变化的程度不同。这些结果表明星豹蛛体内CAT活性与重金属的种类密切相关。该结论与吴启仙等对重金属对昆虫抗氧化酶影响研究进展[14]中所述的结果相同。

GST 能够催化还原性谷胱甘肽(GSH)的硫醇基与亲电化合物结合，增加后者的可溶性，有

利于将其从细胞内排出，同时其也参与清除由重金属引起的对机体有害的氧自由基，保护机体免遭氧化压力的胁迫[15]。本文结果显示，在短时间内可以抑制星豹蛛的GST 活性，原因可能是星豹蛛初次接触铅、铬溶液，尚处于敏感阶段。随着时间延长又激活星豹蛛的GST 活性，GST 活性的升高，可能是昆虫的一种应激防御反应，增强对重金属的解毒代谢，以抵御由重金属引起的氧化损伤。这些结果表明，GST 活性的变化与作用时间密切相关，与刘耀明等研究镉和铬急性染毒对中华稻蝗解毒酶及多酚氧化酶的影响的结果相似[16]。

综上所述，铅、铬胁迫星豹蛛，在作用不同时间后其体内的CAT、SOD、GST的活性受到了不同程度的影响，三者交互作用，在某种程度上可以激活相关抗氧化酶的活性，从而增强机体的解毒能力，降低或避免外源物对机体的损伤，但重金属染毒后在星豹蛛体内是否还有更有效的解毒途径，有待于进一步研究和探索。

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(编辑：张贵森)