蛋白标志物在荷人卵巢癌裸鼠移植瘤与化疗后移植瘤中的表达差异

·论著·

蛋白标志物在荷人卵巢癌裸鼠移植瘤与化疗后移植瘤中的表达差异

孙亚楠侯连国贾晓鹏崔娜张彩虹

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20130005)

作者单位： 050082石家庄市，中国人民解放军白求恩和平医院妇产科(孙亚楠、张彩虹)；河北医科大学生化教研室(侯连国)；河北医科大学第三医院(贾晓鹏);河北医科大学第二医院(崔娜)

【摘要】目的建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，给予顺铂(DDP)最大可耐受剂量化疗(maximumtolerateddose chemotherapy，MTD-DDP)和顺铂低剂量节拍化疗(low-dose metronomic chemotherapy，LDM-DDP)，探讨初发移植瘤与不同模式化疗后移植瘤中乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistant protein，BCRP)、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和肿瘤干细胞标记物ALDH1(aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1)表达水平的差异。方法用人卵巢癌SKOV3细胞株建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，60只裸鼠随机分为MTD-DDP组、LDM-DDP组和对照组，每组20只。2周成瘤后处死对照组裸鼠，用蛋白质印迹法(Western Blotting, WB)检测移植瘤组织中BCRP、P-gp和ALDH1的表达水平。MTD-DDP组、LDM-DDP组在化疗结束后处理裸鼠，用相同方法检测化疗后移植瘤组织中移植瘤组织中BCRP、P-gp和ALDH1的表达水平，探讨造成差异的原因。结果60只裸鼠均成瘤，成瘤率为100%。LDM-DDP和 MTD-DDP组的BCRP蛋白表达水平低于对照组，且LDM-DDP组BCRP表达水平低于MTD-DDP组(P<0.05)。 MTD-DDP组、LDM-DDP组P-gp蛋白表达均高于对照组，且LDM-DDP组P-gp表达水平低于MTD-DDP组(P<0.05)。LDM-DDP和MTD-DDP组的ALDH1表达低于对照组，且LDM-DDP组ALDH1表达水平低于MTD-DDP组(P<0.05)。结论与LDM-DDP组相比较，MTD-DDP组化疗后残余瘤中耐药相关蛋白高表达，且更易富集肿瘤干细胞标志物ALDH1，LDM是一种未来可供选择的，目的在于提高化疗敏感性、降低复发耐药的化疗模式。

【关键词】卵巢上皮性癌；DDP化疗；多药耐药相关蛋白；蛋白印迹法

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.22.036

【中图分类号】R 737.31【文献标识码】A

收稿日期：(2015-06-15)

卵巢癌是女性癌症相关死亡的主要原因[1]，卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)往往占卵巢癌总发病率的90%，该病通常在晚期发现，迄今为止，没有高度有效的针对治疗策略。传统的治疗通常包括肿瘤细胞减灭术和后续以铂类药物为基础的联合化疗，但近1/2患者在18月内复发[2]，同时因为EOC容易产生化疗耐药，EOC极易复发，使得5年生存率长期徘徊在20%～40%[3]。传统的最大耐受剂量化疗(MTD)往往是通过杀死对化疗敏感的绝大部分增殖状态的卵巢癌细胞，可以有效控制肿瘤,但副反应较重且易产生化疗耐药。因此，就MTD模式，有学者提出低剂量节拍化疗(LDM)，LDM模式是一种新的化疗模式，化疗总剂量需等同于MTD化疗模式[4,5]。化疗方式通常采用常规化疗剂量1/10～1/3，高频率/脉冲式持续(一般为每天或每3天或每7天)给药方式，不仅能有效的缩短化疗间歇期，增加肿瘤细胞在化疗药物中暴露的时间，还能以新生血管系统的内皮细胞作为靶目标，减轻化疗副反应，且很少产生骨髓抑制，从而成为一个有吸引力的和行之有效的抗肿瘤复发的策略[6-8]。本实验通过建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，分别给予MTD化疗和LDM化疗，观察未给予化疗及给予上述两种化疗后移植瘤中相关耐药蛋白和肿瘤干细胞标记物ALDH1表达差异，探讨造成差异可能的机制，为临床寻找一种新的化疗模式提供思路。

1材料与方法

1.1实验动物本实验选取雌性BALB/c裸鼠，小鼠6～8周龄，体重18～20 g，购自中国医学科学院实验动物研究所，合格证为SCXK(京)2013-004，在SPF级条件下饲养，所有动物实验操作过程均遵照国际动物委员会制定的伦理道德规范。

1.2细胞株人卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3由中科院上海细胞库提供，中高分化，贴壁生长，本实验室传代培养，SKOV3细胞接种于含10%胎牛血清(FBS)的McCoy’s-5A液体培养基中，培养瓶置于37℃恒温，含5%CO2的细胞培养箱中。

1.3实验试剂McCoy’s-5A培养液购自美国Gibico公司；注射用顺铂购自云南生物谷灯盏花药业；Anti-BCRP 抗体，Anti-P-gp 抗体，Anti-ALDH1抗体购自美国Millipore 公司。

1.4建立裸鼠皮下移植瘤模型取对数生长期SKOV3细胞1×107个接种于裸鼠右侧大腿皮下，建立荷人卵巢癌异种移植瘤模型。将60只裸鼠随机分为3组，对照组，MTD-DDP组，LDM-DDP组，每组20只。成瘤后处死对照组裸鼠，进行Western-Blot法检测移植瘤中BCRP、P-gp和ALDH1的表达。无菌条件下取出裸鼠皮下移植瘤，提取组织总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取30 μg等量蛋白上样，10%SDS-PAGE胶用以分离蛋白，20 V恒压、130 mA条件下转膜30 min。封闭液封闭蛋白转移膜1 h。加入一抗BCR抗体、P-gp抗体及ALDH1(1∶500稀释)，室温孵育，12 h。第2天洗涤未结合一抗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000稀释)，室温孵育1 h。避光显色，X线胶片曝光。胶片经URP Imagestore 7500凝胶成像分析系统扫描，分析条带灰度值。待测蛋白表达量与内参照β-actin表达量进行对比，表示蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.5化疗总剂量相同，MTD-DDP组：DDP 3 mg/kg，1次/3 d，腹腔注射共6次；LDM-DDP组DDP1 mg/kg，1次/d，腹腔注射共18次。

2结果

2.1成瘤率60只裸鼠皮下异种移植瘤模型2周均能成瘤，成瘤率100%。

2.2蛋白质印迹法检测结果BCRP蛋白表达：BCRP蛋白表达水平均在MTD-DDP组和LDM-DDP组均高于对照组(P<0.05)；而LDM-DDP组BCRP蛋白表达显著低于MTD-DDP组(P<0.05)。P-gp蛋白表达：P-gp蛋白表达水平在MTD-DDP组和LDM-DDP组均高于对照组(P<0.05)；而LDM-DDP与MTD-DDP组之间P-gp蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。ALDH1表达：ALDH1蛋白表达水平在MTD-DDP组和LDM-DDP组均高于对照组(P<0.05)；而LDM-DDP组中ALDH1蛋白表达水平低于MTD-DDP组(P<0.05)。见表1、图1。

表1　荷人卵巢癌裸鼠模型中，在对照组，MTD组和LDM组中

注：与对照组比较，*P<0.05；与MTD组比较，#P<0.05

图1荷人卵巢癌裸鼠模型中，在对照组，MTD组和LDM组中BCRP、P-gp和ALDH1蛋白表达水平检测

3讨论

MTD化疗模式能有效抑制肿瘤生长，但伴有较重的化疗副反应，而临床上在两次化疗之间常存在间歇期，而在间歇期内，部分肿瘤细胞处于细胞分裂周期的静止期[9,10]，可以躲避化疗及放疗的攻击，高表达耐药蛋白，相比较成熟细胞，其化疗敏感性低，从而迅速增殖[11]。

LDM化疗模式通常采用常规化疗剂量1/10～1/3，高频率/脉冲式持续(一般为每天或每3天或每7天)给药方式，不仅能有效的缩短化疗间歇期，增加肿瘤细胞在化疗药物中暴露的时间，还能以新生血管系统的内皮细胞作为靶目标，阻断内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，CEP)的活化，减轻化疗副反应，因为针对内皮细胞，LDM化疗模式几乎不产生骨髓抑制，从而成为一个有吸引力的和行之有效的抗肿瘤复发的策略。

研究人员认为，肿瘤具有异构性，导致肿瘤复发的细胞，在肿瘤中只占据一小部分，负责肿瘤的起始、维持和发生，称之为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)。ALDH1是维甲酸信号通路(干细胞分化的关键途径)的中心表达酶类，通常在干细胞中高度表达。ALDH1已经从大量患者样本和试验中鉴定和分离出来，也被视作一些列恶性肿瘤的CSC标志蛋白，包括乳腺、结肠、大脑、肝脏、肺和卵巢[12-16]。传统的MTD模式无法有效的针对这一小部分干性最强的卵巢癌干细胞做出强有力的杀伤，与此相反的是，MTD化疗模式更能富集具有干性特征的卵巢癌干细胞。本研究发现，MTD-DDP组ALDH1蛋白表达高于LDM-DDP组和对照组。说明在卵巢癌内部的肿瘤细胞具有层级制度，MTD-DDP模式能大量杀死对化疗敏感的肿瘤细胞，对化疗不敏感的细胞开始激活，占据主导地位，随着化疗次数增多，不敏感细胞逐渐增多，最终导致化疗耐药，肿瘤复发。

P-gp和BCRP是最常见的多药耐药ABC转运蛋白。P-gp通过与抗肿瘤药物相结合，依赖ATP水解能量将细胞内的药物泵出细胞外，从而降低胞内化疗药物的浓度，使得肿瘤耐药。除此之外，如果正常细胞持续表达P-gp往往被认为是癌变标志。文献报道，P-gp在肿瘤组织中含量高的患者对化疗敏感性差，容易复发和转移，预后较差[17]。本研究显示，MTD-DDP组、LDM-DDP组P-gp蛋白表达均高于对照组(P<0.05)，但前二者之间无明显差异，我们因此推测，P-gp能够在EOC化疗耐药起到一定的作用，但并非主导作用。BCRP也是多耐药蛋白，它作用的机制是通过将药物从细胞中“排出”，进而影响化疗药物的吸收，改变化疗药物的作用和浓度。徐志宏等研究学者提出BCRP的过度表达与肿瘤复发明显相关[18]，在耐药方面起很大作用。一旦肿瘤细胞过度表达BCRP，则可呈现对多种化疗药物的抵抗性[19]。本研究显示，MTD-DDP组、LDM-DDP组P-gp蛋白表达均高于对照组(P<0.05)，且LDM-DDP组BCRP蛋白表达显著低于MTD-DDP组(P<0.05)，说明LDM模式确实可以降低化疗药物的耐药性，减少复发。

综上所述，本研究中，耐药相关蛋白BCRP、P-gp和肿瘤干细胞标记物ALDH1在经过化疗的裸鼠移植瘤内含量明显高于未经化疗的裸鼠，以MTD组最高，说明MTD组能够在某种程度上富集卵巢癌干细胞，使得对化疗敏感度低的细胞富集，而LDM模式能够降低卵巢癌干细胞比例，持续无间歇给药能够阻止CSCs重新形成肿瘤，增强化疗敏感性，因此如果能将LDM化疗模式成功的应用于卵巢癌临床化疗中，将极大的增强抑瘤效果，减低复发。

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