苦豆子总生物碱对小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用的研究

苦豆子总生物碱对小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用的研究

李建光1， 牛清芝2， 杨晓艺1， 曾诚3， 黄伟4

(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐830011;2中国石油乌鲁木齐石化公司职工医院药械科， 乌鲁木齐830019;

3新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐830011;4中国医学科学院北京协和医学院药物研究所药物制剂研究室， 北京100050)

摘要：目的研究苦豆子总生物碱对小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用。方法苦豆子总生物碱提取并纯化，处理成澄清的药物溶液后用于细胞给药。CCK-8法测定不同浓度的苦豆子总生物碱作用24 h后4T1细胞存活率。流式细胞术检测给药24 h后4T1细胞凋亡率。结果与对照组比较，实验组药物浓度为5.00 mg/mL时，4T1细胞存活率为63.05%；药物浓度为10.00 mg/mL时，4T1细胞存活率为20.30%,随着给药浓度的增加，细胞存活率呈明显下降趋势。实验组药物浓度为6.25 mg/mL时，细胞凋亡率为11.4%；药物浓度为10.00 mg/mL时，细胞凋亡率为41.7%,随着给药浓度的增加，细胞凋亡率明显增加。结论苦豆子总生物碱能诱导细胞凋亡，对小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖有明显抑制作用。

关键词：苦豆子总生物碱； 4T1细胞； 细胞增殖； 抑制； 细胞凋亡

中图分类号：R961文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.010

[收稿日期：2014-09-21]

基金项目：新疆医科大学科研创新基金(XJC2012134)

作者简介：潘燕(1975-)，女，硕士，副主任医师，研究方向：脑血管疾病及周围神经病的诊治，E-mail：panyan786016@sina.cn。

基金项目：新疆医科大学第一附属医院科研奖励基金(2011YFY11)； 吴阶平医学基金(320.6799.1143)； 乌鲁木齐市科技技术计划项目乌市感染与肿瘤重点实验室(H111313001)

作者简介：孙毅(1982-)，男，硕士，住院医师，研究方向:肿瘤的基础及临床研究工作。

Proliferation inhibition and apoptosis induction effects of total alkaloid of

Sophora Alopecuroides on mouse mammary tumor 4T1 cells in vitro

LI Jianguang1, NIU Qingzhi2, YANG Xiaoyi1, ZENG Cheng3, HUANG Wei4

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；2Departmentof

Pharmacy,WorkersHospital,ChinesePetroleumUrumqiPetrochemicalCorporation,

Urumqi830019,China;3CollegeofTraditionalChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China;4DepartmentofPharmaceutics，InstituteofMateriaMedica,

ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the proliferation inhibition and apoptosis effect of the total alkaloid of sophora alopecuroides (TASA) on mouse mammary tumor 4T1 in vitro. MethodsTASA was extracted and purified, and then TASA was administrated to mouse mammary tumor 4T1 cells. The inhibitory effect of TASA at different concentrations on 4T1 cells was determinated by CCK-8 assay at the time point of 24 h. The effect of TASA on 4T1 cells apoptosis was detected by flow cytometry. ResultsWith the drug concentration of 5.00 mg/mL, 4T1 cells survival rate was 63.05%, while the drug concentration reached to 10.00 mg/mL, 4T1 cells survival rate was 20.30%, which suggested that 4T1 cells survival rate significantly declined with the increase of drug concentration. With the drug concentration of 6.25 mg/mL, the apoptosis rate was 11.4%, while the drug concentration was 10.00 mg/mL, the apoptosis rate was 41.7%, which showed that apoptosis rate was increased significantly with the drug level increasing. ConclusionTASA could induce cell apoptosis of 4T1 cells, and it had a remarkable inhibitory effect on the proliferation of 4T1 cells.

Key words: total alkaloid of sophora alopecuroides; 4T1 cells; cell proliferation; inhibition; apoptosis

苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)为豆科槐属植物，多年生草本植物[1]。别名苦豆根、苦豆草，维吾尔语称“布亚”，现收载于《中国药典》、《新疆中草药》和《维吾尔药志》等[2]。生物碱是苦豆子中主要的代表性活性成分群，目前发现的生物碱主要属于喹诺里西啶类，包括槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐胺碱等，共计20余种[3-6]。随着研究的不断深入，苦豆子总生物碱在抗肿瘤方面的作用越来越受到学者们的关注。近年来研究结果表明，苦豆子中的不同生物碱成分对人胃癌 MGC-803细胞、结肠癌 SW620细胞、人红白血病细胞株K562、肝癌细胞 HepG2、Lewis肺癌、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞等肿瘤细胞增殖均有抑制作用[7-9]。本课题组前期研究大部分是针对生物碱单体作用于肿瘤细胞、生物碱单体与其他药物联合用药作用于肿瘤细胞的研究。

乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一，在一些国家和地区其发病率高居女性肿瘤发病之首位，乳腺癌发病机制异常复杂，至今尚未完全阐明，因而缺乏有效的防治措施[10]。新疆是全国苦豆子主产区，可利用的自然资源丰富。苦豆子总生物碱作为具有开发前景的天然药物组份，对其抗肿瘤作用的研究有利于充分发挥传统民族药在抗肿瘤方面的独特效用。目前，苦豆子总生物碱有效部位治疗乳腺癌的研究未见报道。小鼠乳腺癌细胞4T1形成肿瘤的生长及转移特性与人类乳腺癌十分相似[11]。本研究以小鼠乳腺癌为研究对象，探讨苦豆子总生物碱对4T1细胞的体外增殖抑制及诱导凋亡作用，旨在为更进一步的研究与应用提供必要的基础和依据。

1材料与方法

1.1药材、仪器与试剂苦豆子(由新疆药物研究所提供，经新疆药物研究所何江副研究员鉴定为真品)。调温电热套(KDM型，山东省鄄城永兴仪器厂)，旋转蒸发器(RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂)，电热恒温水浴锅(DZKW-S-4型，北京市永光明医疗仪器厂)，离心机(BY-400C-1型，北京白洋医疗器械有限公司)，台式高速冷冻离心机(TGL-16K型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，酶标仪(MODEL550型，日本BIO-ROD公司)，流式细胞仪(Epics Altra型，beckman coulter公司)，超净工作台(BCM-1300A，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，CO2培养箱(HERAcell 150i，Thermo Fisher公司)。大孔吸附树脂(HPD500型，沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，0.25%胰酶(批号：140609，北京协和细胞资源中心)，胎牛血清(批号：20130511，兰州百灵生物技术有限公司)，1640培养液(批号：201305，Thermo Fisher公司)，CCK-8(批号：JA611，DOJINDO laboratories)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号：NB8826，欣博盛生物公司)。

1.2细胞小鼠乳腺癌4T1细胞株由中国医学科学院药物研究所黄伟副研究员赠予。

1.3方法

1.3.1苦豆子总生物碱的提取与纯化苦豆子药材粉碎成粗粉，按料液比1∶8 ( m/V )加入70%乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并滤液抽滤，滤液65℃条件下减压回收乙醇，浓缩至每1 mL浓缩液含生药0.4 g，采用HPD500型大孔吸附树脂进行分离纯化，吸附速度1～2 BV/h，吸附时间>6 h，用蒸馏水洗脱4 BV后用40%乙醇洗脱5 BV，洗脱速度1～3 BV/h，收集40%乙醇洗脱液，浓缩干燥，得苦豆子总生物碱纯化物粉末，置于干燥器中备用。

1.3.2苦豆子总生物碱药物溶液的配制取苦豆子总生物碱纯化物粉末加入PBS中溶解，配制成浓度为25 mg/mL的药物溶液，完全溶解后于离心机中离心，12 000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤，即得用于细胞给药的澄清药物溶液。

1.3.3细胞存活率测定采用CCK-8法测定不同浓度苦豆子生物碱药物溶液作用24 h后4T1细胞存活率。将细胞融合度达到95%的对数生长期4T1细胞接种于96孔板中(100 μL/孔)，置于5%CO2、37℃培养箱中，培养24 h细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的药物溶液。实验设空白组、对照组和实验组。空白组按100 μL/孔加入含10% FBS的1640培养液，设6个复孔；实验组分别加入5.00、10.00 mg/mL浓度的药物溶液100 μL，每个浓度均设6个复孔；对照组设6个复孔，每孔加入细胞悬液100 μL(含8×103个细胞)。继续培养24 h后，每孔加入10%CCK-8和细胞培养混合溶液100 μL，继续孵育3 h，采用酶标仪于450 nm处测定吸收值，并以650 nm为参考波长，计算细胞存活率，公式如下：

细胞存活率=[1-(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100%

1.3.4细胞凋亡检测采用流式细胞术检测不同浓度苦豆子总生物碱药物溶液作用24 h后4T1细胞凋亡率。取对数生长期的4T1细胞，经胰酶消化得单细胞悬液，1 100 r/min离心4 min，收集细胞，用含有10% FBS的1640培养液调整细胞密度，以1×105个/孔加入12孔板，1 mL/孔，37℃、5% CO2细胞培养箱培养24 h。对照组设4个复孔，实验组分别加入6.25、10.00 mg/mL浓度的药物溶液100 μL，每个浓度设3个复孔。37℃、5% CO2细胞培养箱培养24 h后，用5 mL EP管收集各组细胞。吸取细胞培养液，PBS洗涤1次，收集洗涤液，加入0.5 mL胰酶消化细胞，加入1 mL培养液来回吹打20次，收集培养液，1 100 r/min离心4 min，吸去上清液，加入1 mL PBS洗涤，此过程重复2次，加结合液500 μL混合均匀，吹打均匀。室温避光操作，加Annexin V-FITC 5 μL混合均匀，再加PI 5 μL混合均匀，室温避光染色15 min，过300目筛网，上流式细胞仪检测。

2结果

2.1苦豆子总生物碱对4T1细胞增殖的抑制作用与对照组未经处理的4T1细胞相比，实验组药物浓度为5.00 mg/mL时，4T1细胞存活率为63.05%；药物浓度为10.00 mg/mL时，4T1细胞存活率为20.30%。相同作用时间增加给药浓度，细胞存活率明显下降(图1)。

图1　不同浓度苦豆子总生物碱作用24 h后4T1细胞存活率

2.2苦豆子总生物碱对4T1细胞凋亡的影响实验组药物溶液浓度为6.25 mg/mL时， 4T1细胞凋亡率为11.4%；药物溶液浓度为10.00 mg/mL时， 4T1细胞凋亡率为41.7%。与对照组相比，实验组细胞凋亡率明显高于对照组，且随着给药浓度的增加，细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明显增加(图2)。

A: 对照组

B: 6.25 mg/mL药物溶液

C: 10.00 mg/mL药物溶液

图24T1细胞给药后凋亡检测结果

3讨论

本研究采用CCK-8法测定细胞存活率，结果表明，苦豆子总生物碱对小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖有明显的抑制作用。细胞凋亡是主要抗癌作用机制之一[12]。研究发现，细胞凋亡的信号转导通路中包含着2条主要途径，即外源性通路(主要由死亡受体介导)与内源性通路(主要通过线粒体相关蛋白活化)[13]。本实验对4T1细胞的活性进行检测，结果显示，4T1细胞的存活率随苦豆子总生物碱给药浓度的增加而减小；根据流式细胞术分析可知，苦豆子总生物碱作用后，实验组细胞凋亡率明显高于对照组，且随着给药浓度的增加，细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明显增加。苦豆子总生物碱能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖。

苦豆子生物碱抗肿瘤作用机制广泛，涉及多个途径，而且可能是多途径同时起作用而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。随着研究的深入，将有更多新的苦豆子生物碱抗肿瘤作用机制不断被发现。苦豆子生物碱对多种癌细胞有较好的抑制活性，对部分癌细胞显示出较为特殊的抗癌机制，可见苦豆子总生物碱可能是一种广谱抗癌组合物，也是一种值得深入研究和作为抗癌药物模型的组合物。针对目前苦豆子中生物碱抗肿瘤作用机制研究较为分散，且对不同的肿瘤细胞显示出多种作用机制，在未来的研究工作中应选取适当的肿瘤细胞进行针对性研究，以及针对某一肿瘤细胞进行多机制的探索研究。

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(本文编辑施洋)

通信作者：包永星，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:肿瘤综合治疗的研究工作,E-mail：baoyx@vip.sina.com。