新疆维、汉族鼻咽癌患者LMP2A特异性T细胞免疫反应差异性研究

新疆维、汉族鼻咽癌患者LMP2A特异性T细胞免疫反应差异性研究

谭遥1， 陈婷1， 李亚伟1， 王若峥1,2

(新疆医科大学1附属肿瘤医院放疗中心,2新疆肿瘤学重点实验室， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨新疆维吾尔族、汉族鼻咽癌患者外周血潜伏膜蛋白2A(LMP2A)特异性T细胞免疫反应的差异性。方法选择114例鼻咽癌初治患者(维吾尔族48例,汉族66例)及120例健康志愿者(维吾尔族50例,汉族70例)，治疗前抽取肘静脉血，分离外周血单个核细胞，采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测外周血中LMP2A特异性T细胞(CTL)水平。比较鼻咽癌患者与健康志愿者、维吾尔族患者与维吾尔族健康志愿者、汉族患者与汉族健康志愿者、维吾尔族患者与汉族患者外周血LMP2A特异性CTL频数的差异。结果鼻咽癌患者的外周血LMP2A特异性CTL水平明显低于健康志愿者(P=0.031 6)；维吾尔族鼻咽癌患者和汉族鼻咽癌患者分别与同民族健康志愿者比较，外周血LMP2A特异性CTL频数均低于同民族健康志愿者(P=0.032 9，P=0.047 9)，差异有统计学意义；汉族鼻咽癌的外周血中LMP2A特异性CTL水平亦高于维吾尔族鼻咽癌患者，差异有统计学意义(P=0.022 7)。结论鼻咽癌患者对于LMP2A特异性的T细胞免疫反应明显低于健康人群，这可能是EBV潜伏感染，最终导致鼻咽癌发生的重要原因之一。

关键词：鼻咽癌； 潜伏膜蛋白2A； 酶联免疫斑点法； 特异性T细胞

中图分类号：R739.63文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.001

[收稿日期：2014-10-21]

基金项目：国家自然科学基金(81160327)，新疆维吾尔自治区国际合作项目(201141138，20126024)，科技部国际合作项目(2012DFA31560)

作者简介：刘凯(1989-)，男，在读硕士，研究方向：头颈部肿瘤放射治疗基础与临床。

On the differential immune reaction of the LMP2A spicific T cell in Han and Uyghur

nasopharyngeal carcinoma patients in the Xinjiang Autonomous Region of China

TAN Yao1， CHEN Ting1， LI Yawei1, WANG Ruozheng1,2

(1DepartmentofRadiationOncology,AffiliatedTumorHospital,2KeyLaboratoryofOncology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract：ObjectiveTo study the differential immune reaction of the LMP2A spicific T cell in Han and Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients in Xinjiang. Methods114 Nasopharyngeal Carcinoma patients (Uyghur 48, Han 66) and 120 healthy donors (Uyghur 50, Han 70) were included in the study. 10 ml blood were taken before any treatment, PBMCs were separated and LMP2A specific T cell responses were measured by using ELISPOT assay. Compare the differences between nasopharyngeal carcinoma patients and healthy donors, Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients and Uyghur healthy donors, Han nasopharyngeal carcinoma patients and Han healthy donors, Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients and Han nasopharyngeal carcinoma patients. ResultsWe found significant difference of LMP2A specific T cell responses between NPC patients and healthy donors (P=0.031 6). We also found the significant difference of LMP2A specific T cell responses in another 3 groups：Uyghur NPC patients and Uyghur healthy donors (P=0.032 9)， Han NPC patients and Han healthy donors (P=0.047 9)， Uyghur and Han NPC patients (P=0.022 7). ConclusionThe lower immune reaction of the LMP2A spicific T cell in nasopharyngeal carcinoma patients may be one of the most important reasons about latent EBV infection, and eventually lead to the occurrence of nasopharyngeal carcinoma.

Key words: nasopharyngeal carcinoma; latent membrane protein 2; enzyme link immunal spot; specific T cells

鼻咽癌是来源于鼻咽部上皮的一种恶性肿瘤，其在我国东南沿海地区高发，在众多的发病因素中，EB病毒(Epstein-Barr viru,EBV)的感染仍然是鼻咽癌发病的主要因素之一[1-4]。研究表明EBV主要表达潜伏膜蛋白1、2(LMP1、2)、EBV病毒核抗原1(EBNA1)等抗原[5]。其中LMP2又可以分为LMP2A、LMP2B，LMP2A被认为可以提高上皮细胞生长和分化能力，并且与鼻咽癌的侵袭和转移有一定的相关性,属于功能结构；LMP2B则通过调节LMP2A、LMP1的功能发挥作用。在人体内针对病毒的免疫反应中，细胞免疫起主要作用，而T细胞是细胞免疫中能够直接杀伤外来入侵抗原的主要细胞之一。EBV作为一种外来病毒可以在鼻咽癌患者体内长期潜伏并最终在局部产生肿瘤组织，是否可以推测鼻咽癌患者对EBV的特异性T细胞反应减弱，最终导致EBV逃脱了机体的免疫监视[6]。基于这一假设，本研究采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)对初治114例维吾尔族(维族)、汉族鼻咽癌患者LMP2A特异性多肽介导的T细胞免疫反应进行检测，并与健康人群进行比较，现报道如下。

1资料与方法

1.1研究对象选择新疆医科大学附属肿瘤医院头颈放疗科2008年1月-2013年12月收治的114例鼻咽癌初治患者，其中汉族66例，维吾尔族患者48例，所有患者均经过病理确诊，签署知情同意书。选择新疆医科大学及新疆医科大学附属肿瘤医院的健康志愿者为健康组，其中汉族70例，维吾尔族50例，所有健康志愿者与患者均无亲缘关系，维、汉族鼻咽癌患者一般情况见表1。

表1　维、汉族鼻咽癌患者一般情况

1.2外周血单个核细胞采集患者入院在未行任何治疗前抽取肘静脉血10 mL(EDTA抗凝)，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，胎酚兰染色计数，将细胞重悬，终浓度为4×106个/mL备用进行检测。健康志愿者抽取肘静脉血10 mL(EDTA抗凝)，采用同样的方法制备细胞悬液，用于ELISPOT检测。

1.3LMP2A特异性T细胞免疫反应检测用ELISPOT试剂盒(MABTECH Australia)的一抗包被带硝酸纤维素膜的96孔板，2 h后用含10%胎牛血清(Sigma American)的细胞培养液(1640 Sigma American)阻断反应，向96孔板中加入制备好的细胞悬液50 μL，同时加入LMP2A全基因组特异性多肽(参考EBV-LMP2A多肽库的序列图，由牛津大学MRC人类免疫学实验室合成)，设立阴性对照孔(加入50 μL 细胞培养液)，阳性对照孔加入2 μL植物血凝素(PHA)，将反应体系放入5% CO2、37℃孵育箱中过夜培养。第2天采用无菌PBS洗板6次，加入稀释好的二抗50 μL，加盖后室温放置2 h；再次用无菌PBS洗板6次，每孔中加入稀释好的三抗，加盖后室温下放置45 min；按说明书配制ALP显色液，每孔加入50 μL，加盖后室温下放置15～20 min，去离子水冲洗96孔板。

1.4ELISPOT实验结果的判定标准及质控根据2006年美国病毒学杂志的报道和国内应用相同技术的研究资料提出的标准[7]，参考文献[8]的判定标准阳性对照为每孔斑点数≥50个/106个细胞，阴性对照为斑点数≤5个/106个细胞。采用AID读板机读取反应斑点数，并记录备统计学分析。为保证实验结果的真实准确，实验试剂采用同一厂家、同一批次；实验设立质控标本，每周进行1次质控检测。

1.5统计学处理应用SAS9.2统计软件对实验数据进行统计学分析，对鼻咽癌患者与健康志愿者的LMP2A特异性T细胞(CTL)免疫反应产生细胞数目进行t检验，分别对维吾尔族患者和汉族患者之间、维吾尔族患者和维吾尔族健康志愿者、汉族患者和汉族健康志愿者之间LMP2A特异性CTL数进行t检验，检验水准P=0.05。

2结果

2.1鼻咽癌患者与健康志愿者LMP2A特异性T细胞免疫反应比较鼻咽癌患者LMP2A特异性CTL水平明显低于健康志愿者，差异有统计学意义(P=0.031 6)，见表2。

表2鼻咽癌患者与健康志愿者LMP2A特异性CTL数比较/(个/106,±s)

LMP2A特异性CTL数-x±s标准误t值P值鼻咽癌患者169.85±188.3022.832.1740.0316健康志愿者295.59±432.1756.26

2.2维吾尔族、汉族鼻咽癌患者与维吾尔族、汉族健康志愿者LMP2A特异性T细胞免疫反应比较维吾尔族和汉族鼻咽癌患者外周血LMP2A特异性CTL水平均低于健康志愿者，差异有统计学意义(P=0.032 9，P=0.047 9)，见表3。

2.3维吾尔族、汉族鼻咽癌患者LMP2A特异性T细胞免疫反应比较维吾尔族鼻咽癌患者LMP2A特异性CTL水平明显低于汉族患者，差异有统计学意义(P=0.022 7)，见表4。

表3维、汉族鼻咽癌患者与维吾尔族、汉族健康志愿者

LMP2A特异性CTL数比较/(个/106,±s)

LMP2A特异性CTL数-x±s标准误t值P值维吾尔族鼻咽癌患者100.00±88.1517.992.1870.0329维吾尔族健康所愿者337.79±526.0490.22汉族鼻咽癌患者207.95±216.5232.640.7110.0479汉族健康志愿者241.25±244.3832.65

表4维族、汉族鼻咽癌患者LMP2A特异性CTL数

比较/(个/106,±s)

LMP2A特异性CTL数-x±s标准误t值P值维吾尔族鼻咽癌患者100.00±88.1517.992.3330.0227汉族鼻咽癌患者207.95±216.5232.64

3讨论

多年来，EBV和鼻咽癌的关系一直是研究的重点，众多的研究也表明EBV是鼻咽癌的主要致病原因之一，LMP是EBV表达的抗原蛋白，其表型包括LMP1、LMP2A和 LMP2B，其中主要具有免疫原性的单元为LMP2A[5-6,9]。在EBV 阳性表达的部分恶性肿瘤，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤中也可检测到LMP2A表达，提示LMP2A可能参与EBV的长期潜伏，帮助其逃过免疫系统的监视，并且可能在恶性肿瘤的发生、发展中起一定作用[10-12]。Li等[13]用LMP2A转染人类角质化细胞株HaCaT，使细胞的增殖和分化能力明显增强，并成功地在裸鼠体内增殖形成移植瘤。在EBV潜伏感染的B细胞中，几乎都可以检测出LMP2A的基因产物，提示其具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用。CTL细胞能否识别并杀伤LMP2A感染的靶细胞是能否清除EBV感染并抑制其进一步发展的关键,近期已经开始有研究将LMP2作为疫苗免疫EBV阳性的鼻咽癌患者，Ⅰ期临床试验结果提示安全且能有效提高特异性免疫反应[14]。

细胞免疫是机体应对病毒感染的主要免疫方式。被病毒感染的细胞或者肿瘤细胞表面可以表达特异性的抗原决定簇(由8～10个氨基酸的序列构成)，抗原决定簇与主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(major histocompatibility complex,MHCⅠ)形成的复合物，从而被CTL细胞识别，并诱导其产生特异性杀伤功能，T细胞同时可以分泌肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、干扰素(IFN)等细胞因子而发挥效应。CTL可以直接杀伤靶细胞。ELISPOT技术是目前国际上先进的检测特异性CTL功能和数量的方法，通过检测分离出的外周血中CTL细胞对于特异性抗原刺激后分泌IFN-γ的淋巴细胞的水平,判断CTL细胞的功能，是目前最为灵敏的免疫功能检测方法，普遍用于各种免疫研究中[15-18]。

本研究显示，鼻咽癌患者外周血LMP2A特异性的CTL细胞数目明显少于健康志愿者，差异有统计学意义。维吾尔族患者与维吾尔族健康志愿者、汉族患者与汉族健康志愿者的比较均得到了相似的结果，提示鼻咽癌患者对LMP2A抗原刺激的免疫反应能力明显低于健康人群。本课题组前期的研究结果也提示鼻咽癌患者外周血中LMP特异性CTL水平在治疗前后存在差异，治疗后6个月明显高于治疗前水平[8]，与本次实验结果相似。由于LMP2对EBV的潜伏感染起到重要的作用，可能是EBV相关的恶性肿瘤发生、发展的重要环节之一[19]。鼻咽癌患者对LMP2A的免疫识别和清除能力下降，可能最终导致EBV在局部长期潜伏感染，并刺激上皮增生，导致肿瘤的最终发生。

本研究发现维吾尔族和汉族鼻咽癌患者外周血中的LMP2A特异性CTL数目存在差异。由于LMP2A已经被发现是通过HLA-A2限制性CTL来被免疫系统识别、产生免疫反应的，Chen等[20]对HLA的研究结果也提示，维吾尔族和汉族人群在HLA-A2的表型上存在明显的差异，维吾尔族人群更接近于高加索人种。维吾尔族和汉族患者LMP2A特异性CTL数目的差异主要可能还是由于2个民族在HLA-A2的分布差异导致的，通过对HLA-A2和外周血LMP2A特异性CTL水平进行联合研究可能可以得到较为明确的答案。

综上所述，鼻咽癌患者对于LMP2A特异性的T细胞免疫反应明显低于健康人群，这可能是EBV潜伏感染、最终导致鼻咽癌发生的重要原因之一，通过提高机体对LMP2A的识别及免疫反应，可能是对鼻咽癌患者进行免疫治疗的途径之一。

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(本文编辑周芳)

通信作者：王若峥，女，博士，教授，主任医师，博士生导师，研究方向：肿瘤放射治疗应用基础和临床应用，E-mail：wrz8526@163.com。