用于激光共聚焦显微镜的光谱扫描机构

用于激光共聚焦显微镜的光谱扫描机构

朱磊1，2*张运海1，2

(1.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 医用光学室，苏州 215163；2.江苏省医用光学重点实验室, 苏州 215163)

摘要：随着生物医学技术的发展，组织样本经常被多种荧光标记物标记，需要通过光谱成像的方法区分出样本中不同的成分。本文在共聚焦显微镜基础上，介绍了一种由精密丝杠和步进电机控制的狭缝机构实现光谱成像的方法，讨论了狭缝缝片的具体设计和狭缝运动精度对光谱带宽和波长准确度的影响。

关键词：共聚焦显微镜；光谱成像；狭缝

作者简介：朱磊，男，1979出生，工程师，主要从事激光共聚焦显微镜成像技术方面的研究，E-mail：freewind2000@163.com。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.01.012

收稿日期：2014-06-06

A spectral scanning mechanism for laser scanning confocal microscopy.ZhuLei1,2*,ZhangYunhai1 2(1.SuzhouInstituteofBiomedicalEngineeringandTechnology,ChineseAcademyofSciences,Suzhou215163,China;2.JiangsuKeyLab.ofMedicalOptics,Suzhou215163,China)

Abstract:This paper introduces a slit mechanism controlled by two precision lead screw and stepper motor, and discusses the accuracy of the spectral bandwidth which is affected by the slit kinematics.

Key words：laser scanning confocal microscopy;spectral imaging;slit

1概述

激光扫描共焦显微镜[1,2](Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)是研究亚微米细微结构的有效技术手段。不同于一般的荧光显微成像，共焦显微镜在光路中加入与物点共轭的探测针孔，起到空间滤波作用，能够去除离焦荧光的干扰，获得高信噪比的图像；共聚焦显微镜通过逐点逐层的扫描方式，可以实现对观测样品区域的三维成像。激光扫描共焦显微镜在组织生物学、细胞生物学、分子生物学、基因学、胚胎学、神经学、病理学、免疫学、流行病学、肿瘤学、细菌学、病毒学等生物和医学领域有广阔的应用。

使用荧光光谱仪对多荧光标记样品产生的荧光，进行光谱分光并探测，需要满足较高的荧光光谱分辨率。由于共聚焦中荧光信号自身就很低，经过光谱分光后的信号则变得更为弱小，因此光谱仪的效率尤为重要。

共聚焦激光显微镜中完成光谱成像首先要对探测的荧光进行光谱分光，光谱分光主要基于两种方式，分别是棱镜分光和光栅分光。在光栅分光中因为对分光元件的旋转精度要求高，机构大都结构复杂，成本较高，不予采用。本文讨论的光谱扫描技术是基于棱镜分光基础上，通过控制可移动狭缝的直线运动设定狭缝宽度及中心位置[3]，移动狭缝实现光谱扫描，完全满足共聚焦的光谱带宽和波长精度要求[4]，结构精简实用，成本较低，同时也能满足在共聚焦显微镜中光谱扫描成像功能的要求。

2激光扫描共聚焦显微镜光谱成像系统的构成

激光扫描共聚焦显微镜光谱成像系统示意图如图1所示，由分光模块、狭缝扫描机构、荧光探测模块构成。

共聚焦成像部分采用经典的技术方案[5]，本文不予详述。下面简单介绍在共聚焦显微镜技术基础上实现光谱成像技术方法，激光光源发出的准直激光经共聚焦光路后在组织样本处聚焦，组织样本中的荧光物质被激光激发后沿相同的光路返回。返回的荧光通过针孔透镜聚焦针孔，如图1所示，再从针孔出射后经准直透镜进入分光棱镜，分光棱镜将荧光光谱展开后再经聚焦透镜聚焦，形成一条光谱带，在光谱带位置处设置有两个可以独立移动的缝片，两个缝片之间形成一个出射狭缝，狭缝的宽度和狭缝相对于光谱带的位置可以根据需要进行设置，透过狭缝后的荧光成分进入到PMT(光电倍增管)，PMT将光信号转换为电流信号，对其进行电信号采样同时记录下扫描单元的位置坐标，进行图像重建就可以生成一幅二维共聚焦图像[6]。

根据设计需求，本系统技术指标如下：工作波长范围为400～700nm。最小光谱带宽为5nm。

图1　光谱成像系统示意图

3光谱分光方案

光谱分光常采用棱镜分光或光栅分光，光栅分光方法光能利用率低，而共聚焦显微成像中，荧光较弱，此外经过光谱分光后，由于荧光被光谱展宽，成像时只取光谱条带中的一部分荧光能量进行成像，有效使用的荧光很微弱，基于此，本研究拟采用光能利用率相对较高的棱镜分光方案。

对于基于棱镜的分光方式，是利用棱镜材料对不同波长的光有不同的折射率这一性质来实现的。由折射定律和几何关系可知，当棱镜工作在最小偏向角情况时，棱镜的角色散为

(1)

A为棱镜顶角，dn/dλ为棱镜的物质色散，n为棱镜材料的折射率。材料的折射率与波长的关系可由Cauchy公式、Schott公式、Sellmeier公式等得到。

(2)

由于不同波长出射光线的偏向角dδ是非线性，这就导致不同波长出射光线在光谱像面上对中心波长 λ的位移也是非线性的，表1给出了不同波长时光谱仪的线色散数及狭缝扫描位移距离的数据。

表1　不同波长狭缝移动量

对棱镜来说，很重要的一个特点是仅具有一个光谱条带，这就使得它不存在光谱级次之间的重叠，其自由光谱范围也不受限制，并且入射光能量得到充分的利用，光能透过效率整体较高，探测的灵敏度高。但是它的色散是非线性的。

分光棱镜的可选材料多种多样，应当按照仪器实际要求进行筛选。本系统初始条件要求谱面不大于6mm，则整个光谱范围的平均线色散倒数dλ/dl不大于50nm/mm，狭缝最小宽度50μm对应的极限分辨率为5nm，则要求任意波长下的线色散倒数dλ/dl不大于125nm/mm。

ZF4的线色散倒数为7.7～72.4nm/mm，F4线色散倒数为16.4～118.6nm/mm，(如图2所示)符合初始条件对线色散倒数的要求，其余材料在部分波段线色散倒数大于125nm/mm，分辨极限达不到要求，重火石玻璃色散能力强，但在蓝、紫波段吸收强，透过率很低，相比而言，火石玻璃更适合。在400～700nm范围内，谱面上的线色散倒数为整个谱面长度为6.87mm，超过初始条件要求，筛选火石玻璃中其余牌号并计算各材料对应的谱面大小，结果如表2。

表2　各牌号火石玻璃对应的谱面长度

图2　相同布局下多种材料线色散倒数

可以看出，所有材料的色散谱面均超过要求。受探测器件本身外形尺寸的限制，当探测器直接接收经过狭缝后的荧光信号，只有在谱面非常狭窄时，感光面才可覆盖最大谱面(400～700nm范围)，此时，极限分辨率已大大超过5nm，且对机构的运动精度要求提高。本系统在现有情况下，加装了焦距100mm的聚焦镜(图1)实现收集整个谱面信号的效果，因此对谱面大小的要求可根据实际情况适当放宽，现有几种火石玻璃均可满足要求。

下面以F4为例，分析棱镜的非线性色散在不同波段对于光谱参数和狭缝位移精度的要求。表3为不同波长下波长间隔50nm对应的谱面大小，不同波长处狭缝移动的要求见表4。

表3　不同波段50nm谱宽对应的实际谱面长度

表4　不同起始波长下模块的光谱性能与对狭缝移动量的要求

续表4

由表4可见，本模块的极限分辨率达到要求，当带宽改变3nm时对应的最小狭缝位移量为25.4μm，因此且当狭缝机构运动精度达到在10μm 时，对应的光谱带宽的选择精度达到了1nm。

4狭缝机构设计

4.1　整体机构

在狭缝的技术指标方面，确定出射狭缝宽度最小50μm，调节范围0.05～6.7mm，缝片调节增量10μm。根据以上需求，设计出如图3所示的狭缝结构：狭缝固定座两端分别固定步进电机，电机带动狭缝滑块运动，左右狭缝固定在两个狭缝运动滑块上，狭缝运动座两端装有位置传感器标定狭缝初始位置，中间防碰撞传感器防止狭缝运动时发生碰撞。工作时，狭缝初始化，左右狭缝分别触发两侧的位置传感器，狭缝缝片复零位。控制系统根据设计确定的特定谱带或波段488nm的位置，驱动两侧电机运动，将左右狭缝精确运动至所需的对应距离。

图3　移动式狭缝机构 1.左缝片驱动电机 2.狭缝固定座 3.左丝杠运动副 4.右丝杠运动副 5.右缝片驱动电机 6.右光耦 7.防碰撞光耦 8.右缝片 9.左缝片 10.左光耦

直线运动副的结构合理是实现左右缝片直线精确控制的前提条件，如未加弹簧消隙时，机构运动产生较大的震颤，无法达到设计要求的最小缝宽及重复定位精度需求，调整为图4所示的弹簧阻尼消隙结构后，证明缝片运动可以满足需求。

图4　螺纹运动副消隙弹簧结构

4.2　狭缝缝片设计

缝片作为移动式狭缝的核心零件，其设计加工及装校都有特殊要求。如图5所示，在设计处理上，缝边留有0.03mm的倒角，用以避免破坏刃口。刃口宽度设计为0.1mm，直线度0.002mm，各表面粗糙度达到P及P1。在材料选择上要选用不锈钢金属材料，热处理后进行表面研磨，其研磨效果直接关系到相关刃面的反射效果。除刃口端面外的其余表面镀黑铬处理，避免反射杂散光。缝片成对检测，缝宽为0.002左右时在30X显微镜下观察，缝纫清晰，间隙均匀，闭合时狭缝全长同时完全闭合，缝刃平直且合拢后无漏光。

图5　缝片刃口形状及公差要求

4.3　位置传感器及消空回设计

位置传感器使用欧姆龙EE-SX770A，定位精度2μm(图6)。

图6　光耦及狭缝触发示意图

如图6所示，左侧缝片从左触发点向中间触发点移动到刚好触发停止，从左缝片触发点开始计步，防碰传感器刚好触发的瞬间停止计步，重复100次，实验记录最大值为3075，最小值为3072，单侧缝片步进2.5μm，对应差值7.5μm。证明缝片重复定位精度在10μm之内。对应的光谱带宽选择精度能够达到1nm。

需要注意的是丝杆传动副机构在运动中总是会有空回产生，虽然机构中增加了消隙弹簧，但并不能完全消除。因此在光耦传感器的使用上往往在达到触发点时，使运动机构多走一点，再反向运动重新触发光耦，这样单项运动可以充分消除运动机构自身的回程误差给系统带来的影响，也是精密运动时对光耦触发常采用的方法。

4.4　狭缝机构的安装固定

图7为狭缝的安装结构图，狭缝机构垂直安装在固定圆盘上，光路在固定圆盘上为分光结构，光路平行于水平基准面，狭缝设计安装时，要求缝片与平面平行度误差不大于0.05mm，因此需要在安装狭缝的同时对狭缝机构水平度进行调校。这对可视化调校方面提出了较高就要求，本系统通过结合CCD(图像传感器)观察狭缝缝片解决了这个问题。

图7　狭缝机构安装示意图

5狭缝机构精度标定

缝片定位精度影响光谱带宽的选择精度，本系统缝片重复定位精度10μm。而缝片定位精度由提供定位基准的位置传感器的定位精度、步进电机的运动精度以及狭缝丝杠传动副的运动精度共同决定。位置传感器定位精度2μm。电机为混合式步进电机，步长0.0025mm，该直线步进电机还可以进行微步进驱动以获得精密的分辨率，并使电机运动时更为平滑，消除微弱颤动对狭缝精密运动带来的影响。为精确标定缝片移动位置和波长的对应关系，用CCD将缝片所在的光谱面成像记录下来，组成1∶1成像系统， CCD像元尺寸为4.4×4.4μm。

采用低压汞灯和特定波长激光测量标定狭缝位置和波长的对应关系，用波段405nm、488nm、638nm的激光和低压汞灯照明狭缝，用CCD探测结果。低压汞灯含有5种波长的光：404.7nm、435.8 nm、546.1nm、577.0nm、579.1nm。将上下缝片分别移动到两侧光耦起始触发点处，狭缝此时张开到最大值。固定左缝片后，移动右缝片至405nm、436nm、488nm、546nm、578nm、638nm对应的位置，重复操作，CCD探测的结果如图8所示。

图8　低压汞灯及405nm、488nm、638nm激光谱线测试图

检测狭缝机构定位精度测试。狭缝缝片依靠步进电机驱动，让电机多次运动，每次运动相同步数，观察停止位置的差异，验证狭缝组件总的定位精度。具体实现时，以光耦为运动起点，挡片离开光耦时开始计数，运动700步，重复多次，停止位置偏差2~3像素，说明狭缝组件重复性为10μm左右。

测试结果证明，移动式狭缝机构不论是狭缝运行速度，还是狭缝重复定位精度都能够较好满足整体设计参数需求。

6结论

通过实际应用效果研判，本狭缝机构能够完成整体设计指标要求。即谱带范围涵盖波长400~700nm，出射狭缝宽度最小达到了50μm，对应5nm光谱带宽，调节范围在0.05～6.7mm。该狭缝结构设计合理，调节方便，响应时间快，结构精巧实用，满足了激光共聚焦显微镜光谱扫描的需求。

参考文献

[1]Zhang Yunhai,Hu Bian, Dai Yakang, et al.A New Multichannel Spectral Imaging Laser Scanning Confocal Microscope. Computational and Mathematical Methods in Medicine， 2013: doi:10.1155/2013/890203.

[2]张运海,杨皓旻,孔晨晖.激光扫描共聚焦光谱成像系统.光学精密工程，2014,22(6)：44-51.

[3] 肖昀,张运海,武晓东,檀慧明.三层介质中激光扫描共聚焦显微镜的模型.激光与光电子学进展. 2014, 2014,51, 041701.

[4] 肖昀,张运海,王真,黎发志.入射激光对激光扫描共聚焦显微镜分辨率的影响.光学精密工程, 2014,22(1):31-38.

[5]James B Pawley.Handbook of Biological Confocal Microscopy. New York:Springer Science+Business Media,2006.

[6] 黄维,张运海,张龙,陈瑞涛,高飞,薛晓君.一种提高共焦显微成像信噪比的积分采样方法[J].电子测量技术,2013,36(7):48-61.