新生儿窒息后血清对人肾近曲小管上皮细胞线粒体膜通透性的影响

新生儿窒息后血清对人肾近曲小管上皮细胞线粒体膜通透性的影响*

赵婧1董文斌1李鹏云3王明勇2邓存良2许开桂1

(四川医科大学附属医院 1.新生儿科,2.传染与免疫研究室, 3.四川医科大学心肌电生理学研究室, 四川 泸州 64600)

【摘要】目的研究新生儿窒息后血清对人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)线粒体膜通透性的影响。方法以人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)为研究对象，实验共分为: 正常对照组、窒息组和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干预组。以20%窒息后24小时血清作为攻击浓度。用四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(JC-1)检测HK-2细胞线粒体膜电位变化；Western blot测HK-2细胞内线粒体中CytC的释放情况。结果①经窒息血清攻击后HK-2细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值(590/530nm)明显降低(P<0.01)，但有了PDTC干预，HK-2细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值明显升高(P<0.01)。②正常组HK-2细胞的胞浆中不含细胞色素C，主要存在于线粒体内，窒息组胞浆中细胞色素C从线粒体漏出较对照组明显增加，相应的在线粒体内表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；PDTC干预组胞浆中细胞色素C表达也有所增加，但大部分仍位于线粒体内，与窒息组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。结论新生儿窒息后血清可影响人HK-2细胞线粒体膜通透性，使线粒体膜电位下降，膜间隙蛋白如细胞色素C等漏出。其胞内信号机制涉及到NF-κB活化。

【关键词】婴儿； 新生； 窒息； 凋亡； 线粒体； 核因子-κB；肾损伤

【中图分类号】R 722.12【文献标志码】A

基金项目：四川省杰出青年学科带头人培养基金(04ZQ026-033);四川省科技厅应用基础项目(2008JY0015)

通讯作者：董文斌，教授，E-mail: dongwenbin2000@163.com

收稿日期：( 2015-01-19； 编辑： 张文秀)

Effect of postasphyxial-serum in neonate on the mitochondria membrane permeability in renal tubular cellsZHAO Jing1,DONG Wenbin1,LI Pengyun2,etal

(1.DepartmentofNewbornMedicine，Luzhou646000,Sichuan,China; 2.LaboratoryofInfectionandImmunity,

TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou646000,Sichuan,China; 3.InstituteofMyocardium

Electrophysiology,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of postasphyxial-serum in neonate on the mitochondria membrane permeability in renal tubular cells. MethodsHuman renal proximal tubular cell line HK-2 cell was used as target cell, which was divided into control group, asphyxia group and pyrrolodine dithiocarbamate (PDTC) blocking group. The attacking concentration of serum was 20%. The mitochondria membrane potential was detected by 5,5,6,6 -tetrachloro-1,1,3,3 -tetraethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide(JC-1), and the release of the apoptogenic mitochondrial proteins cytochrome C was assessed by Western Blot.ResultsThe red/green fluorescence light intensity ratio of mitochondria membrane potential(590/530nm) in asphyxia group and PDTC blocking group were significantly lower than that in normal control group(P<0.01). The red/green fluorescence light intensity ratio of mitochondria membrane potential(590/530nm)in PDTC blocking group was significantly increased(P<0.01) compared with that of other groups. Cytochrome C was not present in the cytosolic fraction of normal cells. Increasing amounts of cytochrome C were detected in the cytosol of postasphyxial-serum treated cells, with a concomitant decrease of cytochrome C in the mitochondrial fraction(P<0.05). In contrast, no significant release of cytochrome C into the cytosol or change in the amount of cytochrome C in the mitochondrial fraction was detected in PDTC-treated cells(P<0.05).ConclusionThese data demonstrates that postasphyxial-serum is a stimulus, which can decrease the mitochondria membrane potential in human renal tubular cells and along with the release of cytochrome C from mitochondria to cytosol. It's intracellular signal transduction mechanism is presumably involved in the activation of nuclear factor-κB (NF-κB).

【Key words】Infant, Neonate; Asphyxia; Apoptosis; Mitochondria; Nuclear factor-κB; Renal injury

新生儿窒息可以导致多器官功能的损伤，肾损伤的发病率最高，其中肾小管又是肾损伤发生最早的部位[1]，而凋亡作为其损伤的一种形式已得到证实[2,3]。线粒体作为真核细胞内的"能量工厂"，其状态决定细胞死亡的类型。不同凋亡途径都是通过作用于线粒体膜来决定凋亡是否发生。线粒体膜电位的下降被认为是凋亡的早期事件[4]。线粒体膜通透性发生改变后还可能使膜间隙中的凋亡蛋白释放，细胞进入不可逆凋亡过程。但在窒息后肾小管损伤中是否发生线粒体膜通透性的改变及其发生机制如何，尚不明确。因此，本研究以人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象，探讨新生儿窒息后血清对HK-2细胞线粒体膜电位的影响及膜间隙蛋白释放情况，旨在探索窒息后肾细胞凋亡的发生机制，为探索新的防治方法提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料及试剂人HK-2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM培养基(GIBCO)；胰酶(美国sigma公司)；胎牛血清(成都雅信科技公司)；吡咯烷二硫氨基甲酸-PDTC(美国sigma公司)；线粒体膜电位检测试剂盒(Biovision)；兔抗人cytochrome C多克隆抗体(美国CST公司)。其余试剂均为市售分析纯。

1.2新生儿窒息后血清的制备[2]选择2007年1～4月在我科住院的足月重度室息新生儿，且均未使用免疫抑制制剂、无明显感染性疾病。在窒息后24h抽取外周血5 mL(肝素抗凝)，2500 r/min离心10min，分离血清，56℃ 水浴30 min灭活补体，微孔滤器过滤除菌，采用DMEM培养液配成20%(体积比，v/v)的攻击浓度待用。

1.3实验分组用质量分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基培养HK-2。实验分为正常对照组、窒息组和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干预组。先在六孔板内平放消毒盖玻片(20mm×20mm),根据分组，将已生长至约80%汇合的细胞在培养瓶中消化成单个细胞，计数后按每孔80000个细胞接种在盖玻片上，加培养液至2ml。待细胞完全贴壁后，均于实验前12小时换液使细胞生长繁殖同步，于37℃，5%CO2条件下进行如下处理：①窒息组:每组培养液换成含20%窒息后血清的DMEM培养液。②PDTC干预组:每组培养液换成含20%窒息血清的DMEM培养液后，同时加40 μmol/L PDTC。③正常对照组:每组培养液换成不含窒息血清的DMEM 培养液，上述培养体系其余培养条件完全一致，在37℃、5%CO2的条件下培养24 h后，观察损伤指标。

1.4检测线粒体膜电位(△ψm)的变化待测细胞培养液换成含终浓度为0.5μM JC-l DMEM培养基，37℃ 、5%CO2避光孵育20min，再用1ml预热的缓冲液漂洗一次。置于激光共聚焦显微镜下观察。设置激发波长为 488nm，发射波长为530nm及590nm分别观察绿色和红色荧光。计算机采集图像荧光值，计算红/绿荧光强度比值。

1.5凋亡蛋白-CytC的释放用胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化细胞后离心收集细胞(4×107个)，用临用前添加了1mM PMSF的线粒体分离试剂轻轻重悬细胞沉淀，冰浴放置10～15 min。然后将细胞悬液转移到2ml的玻璃匀浆器中，匀浆40下(台盼蓝染色，鉴定匀浆效果)。把细胞匀浆在 600g，4℃离心10 min。转移上清到另一1.5ml离心管中，在11,000g，4℃离心10min。吸取上清并储存在-80℃下(胞浆部分)；余下的沉淀用临用前添加了1mM PMSF的线粒体裂解液裂解，裂解后的样品即为线粒体蛋白。用BCA法测定蛋白浓度。取50μg蛋白用于Western blot试验：10%SDS-PAGE电泳，转膜，BSA37℃封闭1h，加入一抗，4℃过夜，漂洗三次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，加入ECL试剂，X线胶片曝光成像。

2结果

2.1窒息后血清导致HK-2细胞线粒体膜电位变化情况JC-1是一种能够渗透到细胞器内并且特异性与细胞中线粒体结合的阳离子染料，是目前被认为检测线粒体膜电位最好的荧光染剂。在线粒体膜电位低时以单体存在，呈绿色荧光(530nm)；而在正常细胞JC-1以多聚体形式存在，发出明亮的红色荧光(590nm)。各组HK-2 细胞内线粒体膜电位在不同波长荧光激发下强度变化见图1。可以看出，在590nm发散波长下，JC-1在对照组HK-2细胞中以多聚体形式存在于线粒体内，发出明亮的红色荧光，有少量以单体形式存在于胞质内，在530nm发散波长下发出浅绿色荧光，两张图片叠加后呈现橙色荧光；窒息组HK-2细胞红色荧光明显变淡，说明线粒体膜电位被去极化，JC-1不能在线粒体内聚集，而在胞质内呈现亮绿色荧光，两张图片叠加后呈现黄绿色荧光；JC-1能在PDTC干预组HK-2细胞线粒体内聚集，并发出红色荧光，少部分存在于胞质内，发出绿色荧光，两张图片叠加后呈现黄色荧光。

可以根据红/绿荧光强度比值来标志线粒体膜电位的丧失[5,6]。应用激光扫描共聚焦显微镜半定量检测细胞内线粒体JC-1荧光强度显示,窒息组和PDTC干预组细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值组(590/530nm)明显低于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。但与窒息组相比，PDTC干预组细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

Table 1　JC-1 fluorescence ratios

注：F=68.558。①与对照组比较，P值为0.000；②与窒息组比较，P值为0.000。

2.2窒息后血清诱导HK-2细胞内细胞色素C胞浆转位目的条带位于分子量14KDa处，用Quantity One分析软件进行光密度(optical density，OD)分析。对照组HK-2细胞的胞浆中不含细胞色素C，主要存在于线粒体内；窒息组细胞胞浆中细胞色素C从线粒体漏出较对照组明显增加，相应的在线粒体内表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)；PDTC干预组胞浆中细胞色素C表达也有所增加，但大部分仍位于线粒体内，与窒息组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，图2。

图1窒息后血清导致HK-2细胞线粒体膜电位变化情况 (激光共聚焦显微镜×400)

Figure 1　The membrane potential of mitochondria

注：F胞浆/线粒体=16.458；①与对照组比较，P胞浆/线粒体值为0.011；②与窒息组比较，P胞浆/线粒体值为0.034。

图2窒息后血清诱导HK-2细胞内细胞色素C胞浆转位

Figure 2The release of cytochrome C from mitochondria after postasphyxial-serum challenge

注：(a)胞浆内细胞色素C； (b)线粒体内细胞色素C

3讨论

线粒体是细胞进行呼吸、电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的重要场所。由于线粒体内外两层单位膜不同的选择通透性，当电子在线粒体内膜电子链上传递的同时，伴随H 由基质内通过质子泵泵出到膜间腔，形成跨线粒体内膜电化学质子梯度(△ψm)。△ψm对维持线粒体的正常功能是必要的。在神经细胞缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡中可以观察到线粒体膜电位(△ψm)的下降[7]，一旦线粒体膜电位完全耗散，细胞就将进入不可逆凋亡过程，最终引起细胞死亡。

新生儿窒息复苏后的过程实际上是缺血再灌注过程，在此过程中机体可产生多种细胞因子、炎症介质及大量氧自由基，爆发全身炎症反应综合症(SIRS)[8,9]，对窒息发病及肾损伤的发生起重要作用。而窒息后肾损伤发生的高峰在24h内[10]，因此本研究采用窒息后1d的血清来攻击HK-2细胞，造成细胞损伤模型。本研究在前期实验证实凋亡是窒息后肾损伤的一种形式的基础上[2]，进一步研究线粒体膜通透性变化在窒息后肾损伤的作用。结果发现，新生儿窒息后血清可诱导HK-2细胞线粒体膜电位下降，使膜间隙蛋白漏出，证明线粒体的功能紊乱可能参与了窒息后血清所致的细胞凋亡。

已知NF-κB是一种信号传递分子，作为细胞内具有多向转录调节作用的核蛋白因子，在炎症反应、氧化应激、细胞增生和凋亡中发挥重要作用[11～13]。也已证实肾小管细胞凋亡的机制牵涉到NF-κB的活化[2]。而本研究在培养体系中加入NF-κB特异性抑制剂PDTC后，可以反转窒息后血清导致的线粒体膜电位下降和阻止细胞色素C释放。进一步证实了NF-κB活化参与的窒息后血清诱导的细胞凋亡可能通过作用于线粒体来介导。其可能的机制牵涉到线粒体内膜非特异性通透性孔道(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的持续开放和Bcl-2蛋白家族的协同作用[14]。

MPTP是由电位依赖性阴离子通道(VDAC)、腺甘酸移位酶(ANT)及亲环素D(Cyp-D)复合物在内外膜交界处构成的一种复合结构[15]。MPTP周期性开放，以维持线粒体内外电化学平稳及稳定状态。研究表明，许多因素可诱导PT孔开放，如促凋亡第二信使Ca 、强氧化剂、NO、神经酰胺、炎症介质和caspase等[16]。而在窒息条件下机体产生大量炎症介质及氧自由基，除了直接参于缺血缺氧性损伤外，这些损伤因子还可能使MPTP持续性开放，形成大的不可逆性的质子流[17]；同时炎症介质还能激活细胞浆内处于无活性状态的NF-κB，使其转位于胞核，进一步上调炎症应答因子，相互形成不断放大的循环过程。激活的NF-κB还能上调Bcl-2家族促凋亡蛋白的表达， Bax与VDAC相互协同作用后有利于MPTP持续开放[18]。这些均使线粒体膜电位下降、耗散，线粒体肿胀，外膜破裂。进而膜间隙蛋白细胞色素C漏出，细胞色素C一旦进入细胞浆，在ATP或dATP的参与下，与凋亡蛋白水解酶激活因子1(apoptosis protease activation factor-1，Apaf-1)及caspase-9共同组成凋亡体(apoptosome)。激活caspase-9，从而启动细胞凋亡蛋白酶级联反应[19]。激活的caspase-9再活化caspase-3，caspase-7，作用于底物蛋白Lamin(核纤层蛋白)、DNA破碎因子、CAD(caspase activated DNAase)多聚腺苷二磷酸核糖聚合物酶(PARP)、ACINUS(apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus)甾体激素反应元件结合蛋白(CRED-1，2)等，继而引起细胞核浓缩及DNA裂解，最终导致细胞凋亡。活化的Caspase还能够加重线粒体膜电位的耗散，在这些相互联系、不断放大的机制作用下，将最终导致HK-2细胞进入不可逆凋亡过程。

4结论

本研究证实了凋亡的线粒体途径参与了窒息后血清诱导的HK-2细胞凋亡。其机制涉及到线粒体膜通透性改变，提示稳定线粒体膜功能，切断凋亡级链反应中的上游环节可能会减轻窒息后肾损伤的发生。

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