早产儿氧暴露后外周血单个核细胞内活性氧簇产生与自噬变化的关系

早产儿氧暴露后外周血单个核细胞内活性氧簇产生与自噬变化的关系*

苏剑董文斌李清平康兰张莲玉卢佑英 翟雪松

(四川医科大学附属医院新生儿科, 四川 泸州 64600)

【摘要】目的观察早产儿氧暴露后外周血单个核细胞内活性氧簇产生与自噬的水平，探讨活性氧簇产生与自噬变化的关系。方法32周以下早产儿根据用氧浓度不同分为三组，FiO2<30%为低浓度吸氧组、FiO2 在30%～40%为中浓度吸氧组、FiO2>40%为高浓度吸氧组。各组氧疗48小后,与对照组中同期未吸氧的32周以下早产儿，经桡动脉采血3ml，分离外周血单个核细胞(PBMCs)及血清，采用激光共聚焦显微镜观察检测细胞内活性氧(ROS)的生成量，硫代巴比妥酸比色法检测血清丙二醛(MDA)含量，丹(磺)酰戊二胺(MDC)结合激光共聚焦显微镜观察自噬表达水平。结果早产儿氧暴露后，随着用氧浓度的升高，PBMCs内ROS。与其余三组相比，高浓度吸氧组中ROS，MDA含量和自噬体表达逐渐增高明显增加(P<0.05)，各组ROS水平与自噬表达水平呈正相关(P<0.01)。结论早产儿氧暴露后，高氧可诱导体内ROS增多，并在细胞内出现自噬现象。ROS可作为信号分子引起和上调细胞发生自噬反应。

【关键词】早产儿; 活性氧; 自噬

【中图分类号】R 722.6【文献标志码】A

基金项目：四川省教育厅科研课题(08ZA150)；四川省卫生厅科研课题(90191)

通讯作者：董文斌，教授，E-mail:DongWenbin2000@163.com

收稿日期：( 2015-01-09； 编辑： 张文秀)

The relationship between reactive oxygen species and autophagy within peripheral blood mononuclear cells in premature infants after oxygen exposed SU Jian, DONG Wenbin, LI Qingping,etal

(DepartmentofNewbornMedicine,TheAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

Abstract【】ObjectiveTo explore the relationship between reactive oxygen species and autophagy within peripheral blood mononuclear cells in premature infants after oxygen exposed. MethodsAccording to different oxygen concentrations, the preterm infants were divided into three groups including low concentration oxygen group (FiO2<30%), middle concentration oxygen group (FiO2 between30- 40%) and high concentration oxygen group (FiO2>40%). Premature infants less than 32 weeks without oxygen were as control group.After 48h, l blood were taken via radial artery and used to separate peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)and serum. The intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected by confocal laser scanning microscopy. The level of malondialdehyde (MDA)in serum were measured by thiobarbituric acid colorimetric. The expression of autophagy within peripheral blood mononuclear cells were observed by monodansylcadaverin combined with confocal laser scanningmicroscope.ResultsAfter premature infants exposed to oxygen, the oxygen, ROS and expression of autophagy and MDA were gradually increased. Compared that of the other three groups, the level of ROS, expression of autophagy and MDA in the high concentration oxygen group were increased significantly (P<0.05). There were positive correlations of autophagy and ROS in PBMCs among the groups(P<0.01). ConclusionHigh oxygen could induce in ROS increased in premature infants. The emergence of autophagy ROS could be used as a signal molecule induced upregulation of autophagy and cell reaction.

【Key words】Premature infants; ROS; Autophagy

近年来，随着医疗技术水平的发展，早产儿(特别是低出生体重儿)的存活率有了明显的提高。由于新生儿(特别是早产儿)呼吸系统疾病常常需要长时间吸入氧气，早产儿机体又缺乏抗氧化能力，则长时间、高浓度的氧疗易引起急慢性肺损伤的发生[1,2]。目前对于高浓度吸氧组诱导肺损伤的发病机制尚不清楚，但认为与氧化应激反应是有重要关系的[3]。研究发现，氧化应激激活的状态下，细胞能增加其自噬。但自噬对细胞有着两方面作用，通过清除受损的细胞器及大分子物质，或在饥饿条件下为细胞提供能量和底物发挥有利的作用；同时，激烈的自噬会导致自噬性细胞的Ⅱ型程序性细胞死亡，加速细胞死亡。目前对于早产儿自噬与氧化应激相关研究较少，其相互作用机制尚不清楚。本研究旨在观察早产儿氧暴露后体内活性氧簇与外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)内自噬表达的情况，来探讨探讨活性氧簇产生与自噬变化的关系。

1资料与方法

1.1一般资料选择2013年3～11月收住于我院新生儿科诊断为呼吸衰竭(Ⅰ型呼衰:PO2<50 mmHg;Ⅱ型呼衰:PO2<50 mmHg,PCO2>50 mmHg)需给氧支持治疗的早产儿30例作为氧暴露组胎龄均为32周以下。根据吸氧浓度不同分为3组，其中低浓度吸氧组10例，吸氧浓度<30%；中浓度吸氧组10例，吸氧浓度30%～40%；高浓度吸氧组10例，吸氧浓度>40%；氧暴露组中男17例，女13例。胎龄28～32周，体质量(1250±156)g。同期选择10例32周以下无其他疾病且未吸氧的早产儿作为对照组，其中男5例，女5例。胎龄30～32周，体质量(1328±109)g。氧暴露组与对照组患儿胎龄、出生体质量比较差异均无统计学意义。本实验排除标准:①ABO溶血和G6PD缺陷。②先天性心脏病。③惊厥、颅内及消化道出血者。④严重感染。

1.2实验方法

1.2.1标本采集氧暴露组患儿在用氧48小是地后，对照组患儿在出生48小时后，征得家属同意并签署知情同意书，经桡动脉采血3ml。其中2ml置于肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs。1ml置于含20g/L 2%依地酸二钠抗凝的试管中混匀，30分钟 h内离心(2500 r/min，10 min)，取上层血清-80℃低温冰箱保存。

1.2.2活性氧(reactive oxygen species，ROS) 检测用激光共聚焦显微镜观察检测细胞内活性氧的生成量，步骤如下：①涂片：分离取得细胞后，调整细胞浓度为2×106ml-1。取100μl细胞悬液涂于防脱玻片上，待干。②固定：4%多聚甲醛固定细胞20min后，PBS洗涤3次。③装载探针：按说明书配制MitoSOX后，加入1ml覆盖于细胞上，37℃孵育30min后，PBS洗涤三次。④染核：每张玻片加入100μlDAPI蓝色荧光染料染细胞核，3min后，PBS洗涤三次。⑤封片，滴入30μl抗荧光淬灭剂于载玻片上，盖上消毒后的盖玻片，完成封片。⑥检测及分析，将处理后的玻片放于激光共聚焦显微镜上，调节模式为UV-VIS，发射波长510nm,采集图像；运用 Image Pro Plus软件测定图像平均荧光强度，其荧光强度越强， ROS表达越多。

1.2.3丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测采用硫代巴比妥酸比色法，在试剂有效期内严格按照说明书进行操作。

1.2.4自噬体检测采用丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin,MDC)自噬体特异性染色剂,终浓度为0.05～0.1mmol/L,作用10～30min洗涤细胞，4%多聚甲醛固定单个核细胞于载玻片上，封片，荧光显微镜观察自噬小体并照相。将MDC染色后的PBMCs用细胞裂解液裂解，应用荧光分度计(激发光波长380nm,发射光波长525nm)测定荧光强度进行定量分析。

1.3统计学方法采用SPSS 18.0软件进行处理，数据均以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及直线相关分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组血清MDA含量随着用氧浓度的升高，患儿外周血血清MDA含量在逐渐增加。由对照组至高浓度吸氧组分别为(9.35±0.22、11.84±2.07、13.38±0.74、15.6±2.01)noml/L。四组MDA含量差异具有显著性。与对照组相比，其余三组MDA含量明显增加。而高浓度吸氧组中MDA也明显高于其余三组(t=9.835，t=6.674，t=4.926；P均<0.05)。见(表1，图1)。

图1各组血清丙二醛含量变化

Figure 1The level of MDA of serum

注：1.对照组；2.低浓度吸氧组；3.中浓度吸氧组；4.高浓度吸氧组。▲与对照组相比P<0.05，●与低浓度吸氧组相比,P<0.05，■与中等浓度吸氧组相比P<0.05

2.2各组PBMCs内活性氧水平的变化随着用氧浓度的升高，ROS水平逐渐升高，其光密度值分别为0.025±0.0014、0.036±0.0007、0.044±0.0017、0.053±0.0015。与对照组相比，差异均具有统计学意义。高浓度吸氧组与中浓度吸氧组，低浓度吸氧组，对照组相比，差异均有统计学意义(t=4.283，t=6.162，t=8.574；P均<0.05)，见图2，表1。

表1　各组活性氧水平及血清丙二醛含量

注：①与对照组相比P<0.05。②与低浓度吸氧组相比P<0.05。③与中等浓度吸氧组相比P<0.05

图2各组外周血单个核细胞内活性氧结果(激光共聚焦×200)

Figure 2Reactive oxygen species within in peripheral blood mononuclear cells (×200)

注：1，对照组 2，低浓度吸氧组 3，中浓度吸氧组 4，高浓度吸氧组

2.3各组PBMCs内自噬体水平的变化分离取得PBMCs后，以MDC染色，通过荧光显微镜观察及定量分析发现，对照组、低浓度吸氧组、中浓度吸氧组、高浓度吸氧组中自噬体水平分别为0.3512±0.0615、0.6213±0.0650、0.8819±0.0514、1.1955±0.0725。高浓度吸氧组中患儿PBMCs内荧光水平(染色的自噬小体)明显比其余三组更高。高浓度吸氧组与中浓度吸氧组，低浓度吸氧组，对照组相比，差异均有统计学意义(t=12.733，t=20.385，t=25.282；P均<0.05)，见图3。

图3各组中外周血单个核细胞内自噬体水平(荧光显微镜×200)

Fig 3The changes in autophagy within peripheral blood mononuclear cells ×200)

注：1.对照组; 2.低浓度吸氧组; 3.中浓度吸氧组; 4.高浓度吸氧组

2.4各组中PBMCs内自噬体水平与活性氧含量的关系对不同氧浓度患儿PBMCs内自噬体水平变化和ROS做相关分析发现ROS光密度值越高，自噬水平升高越明显，二者成正相关(图4)，经统计r=0.995，P<0.01)。

3讨论

自噬是真核细胞在外界刺激或者饥饿状态下，自身组分或结构被双层膜结构囊泡(自噬小囊泡)包裹起来，再与溶酶体融合，最终被溶酶体水解的过程[5～8]。自噬对机体的作用是双向的。在一定程度上，自噬可以维持机体的能量代谢和降低刺激对机体损伤，起到保护机体的作用；但当自噬水平过高时，会因过度"吞噬"胞内物而造成细胞死亡。氧化应激是指体内活性氧(ROS)的生成超过抗过氧化系统防御能力的一种状态。在高氧环境下，线粒体呼吸链通过渗漏机制产生氧自由基，漏出的电子直接与氧结合形成超氧自由基，转变为ROS。ROS可使生物膜发生脂质过氧化、DNA损伤、线粒体功能障碍，从而影响造成细胞功能障碍，引起组织器官的损伤[8]。

本研究显示：随着用氧浓度的升高，各组ROS、自噬表达水平、MDA逐渐增高。但再氧暴露中，高浓度吸氧组ROS和MDA含量增加更为显著。同时，对PBMCs内自噬小体进行检测发现，低浓度吸氧组及中浓度吸氧组PBMCs内自噬小体着色较浅，高浓度吸氧组中，自噬小体着色深，高浓度吸氧组内自噬小体明显增多。这说明高氧可诱导体内ROS增多，并在细胞内出现自噬现象。

图4各组中PBMCs内自噬体水平与活性氧含量的关系

Figure 4The relationship of autophagy and reactive oxygen species within PBMCs among the groups

注：“○”指对照组，“△”指低浓度吸氧组，“□”指中浓度吸氧组“◇”高浓度吸氧组

此外，本研究还发现，ROS含量与自噬体荧光水平的增加是呈正相关的，这与氧化应激反应可作为刺激因素引起细胞内出现自噬现象的报道一致[9]。提示ROS可通过诱发氧化应激反应引起和上调细胞发生自噬反应。这与ROS特别是线粒体ROS可作为信号分子参与自噬的调节是一致的[10]。

4结论与启示

早产儿氧暴露后，高氧可诱导体内ROS增多，并出现细胞自噬现象，但其自噬小体对氧化应激损伤是起保护作用，还是加剧了ROS的蓄积加重了氧化应激损伤，尚有待进一步的研究。

【参考文献】

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