NRP-1和NRP-2在结直肠癌组织中的表达水平及临床意义*

周秋媛，王红莉，李 虹，李 伟，徐艳华(恩施州中心医院病理科，湖北恩施 445000)

结直肠癌为常见消化道恶性肿瘤之一，近年来有年轻化倾向，严重危害患者健康甚至危及生命[1，2]。结直肠癌的发病与多种因素有关[3]，其治疗以手术治疗为主，同时辅助放化疗。早发现、早治疗对结直肠癌病情的缓解具有重要意义[4]。近年来，肿瘤标志物在恶性肿瘤发病中的作用为越来越多学者重视。神经纤毛蛋白1(neuropilin,NRPs)家族中，NRP-1，NRP-2为其主要成员，参与了多种生物学反应。研究发现，NRP-1，NRP-2在非小细胞肺癌[5]和鼻咽癌[6]等恶性肿瘤细胞的增殖和淋巴结转移中发挥重要作用，在这些恶性肿瘤中，NRP-1，NRP-2可出现异常表达。有关NRP-1，NRP-2的表达与结直肠癌发病关系的研究较少。因此，本研究通过检测结直肠癌患者血清中NRP-1，NRP-2的表达水平，旨在探讨NRP-1，NRP-2的表达与结直肠癌发病及临床病理的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2014年12月～2015年9月期间被湖北省恩施州中心医院收治的65例结直肠癌患者和65例肠息肉患者作为研究对象。结直肠癌和肠息肉均经病理科确诊[7]。65例结直肠癌患者年龄41～80岁，平均年龄为65.37±7.81岁，病程3～7年，平均病程为3.26±0.74年，均无吸烟史、饮酒史，其中2例有结直肠癌家族史。肠息肉患者年龄41～80岁，平均年龄为64.81±7.16岁，病程3～5年，平均病程为2.97±0.67年，均无吸烟史、饮酒史、结直肠癌家族史。选择同期在我院健康检查的65例健康女性作为正常对照组，年龄41～80岁，平均年龄65.14±7.36岁，均无吸烟史、饮酒史、结直肠癌家族史。3组年龄、吸烟史、饮酒史、结直肠癌家族史等资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。本研究经入组对象签署知情同意书，并获湖北省恩施州中心医院伦理委员会审批通过。

1.2 试剂和仪器 用真空干燥管抽取入组对象空腹静脉血4 ml，其中42例接受结直肠癌改良根治术的病例在其治疗后再次抽取空腹静脉血4 ml；上述标本用美国Invitrogen公司生产的离心机，以3 500 r/min离心10 min后取上清液保存备用。

1.3 方法 采用美国Invitrogen公司生产的荧光定量PCR仪行RT-PCR，检测结直肠癌和肠息肉及健康人群血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的表达水平，以GAPDH为内参。NRP-1上游引物为：5’ GCGTGAGTGTGTGTGTGTGAGTG 3’，下游引物为：5’AAGCTCTGGGTTTCATGCCA 3’；GAPDH上游引物为：5’AGAAACGAGCCTGCCTTACA 3’，下游引物为：5’ATCAAGTCCAGGGCTTCAGA 3’。NRP-2上游引物为：5’AAGAAGCATTTCAACGCCTCC 3’，下游引物为：5’TGGAATGGAGCAGCGGAGTC 3’；GAPDH上游引物为：5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC 3’，下游引物为：5’TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC’。PCR反应步骤如下：94℃预变性3 min：94℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环，72℃延伸10 min。

1.4 统计学分析 使用SPSS 16.0软件，计量资料执行单因素方差分析或t检验，相关性分析采用Pearson检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组、肠息肉组、对照组血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平 经RT-PCR检测，结直肠癌组NRP-1水平(36.51±4.62 μg/ml)高于肠息肉组(8.19±4.08 μg/ml)和健康对照组(7.92±4.05 μg/ml)，差异有统计学意义(F=50.32，P=0.000)；结直肠癌组NRP-2 mRNA水平(24.59±3.26 μg/ml)高于肠息肉组(5.47±1.11 μg/ml)和健康对照组(5.19±1.05 μg/ml)，差异有统计学意义(F=49.36，P=0.000)。肠息肉组和健康对照组NRP-1，NRP-2 mRNA水平比较，差异无统计学意义(t=1.07，1.15，P=0.762，0.789，>0.05)。

2.2 结直肠癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的水平与临床病理的关系 见表1。经RT-PCR检测，随着患者病理分期的增加、分化程度的降低，结直肠癌组血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈升高趋势。此外，结直肠癌组血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平与患者是否伴肝转移、出现淋巴结转移有关。伴肝转移和淋巴结转移的结直肠癌患者，血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平高于未出现肝转移和淋巴结转移的结直肠癌患者(P<0.05)。结直肠癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平与年龄未表现出明显的相关性(P>0.05)。

2.3 相关性分析 将结直肠癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA等指标进行相关性分析，结果显示，结直肠癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈正相关(r=0.415，P=0.015)。

3 讨论

NRP-1，NRP-2为NRPs家族的成员，在多种生物学过程中扮演重要角色[8，9]。安吉洋等[10]发现，NRP-1在机体的神经损伤及修复过程中发挥重要作用。亦有学者[11]发现，NRP-1在非小细胞肺癌中出现异常表达，NRP-1的水平异常变化与非小细胞肺癌的发病及进展密切相关。孙瑾等[6]的体内外试验研究显示，抑制NRP-1的表达对抑制鼻咽癌细胞的增殖、促进鼻咽癌细胞的凋亡具有显著作用。国外研究[11]发现，除了NRP-1，NRP-2在神经损伤、修复甚至肿瘤疾病的发病进展中亦扮演重色角色。

表1 结直肠癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的水平与临床病理的关系

有关NRP-1，NRP-2的表达水平与结直肠癌关系及其在结直肠癌的发病和病理变化中的作用的相关研究较少，因此本研究对此进行探讨。本研究采用RT-PCR技术检测了结直肠癌、肠息肉及健康者血清中NRP-1和NRP-2的水平，检测结果显示，结直肠癌患者血清中NRP-1，NRP-2呈高水平，明显高于肠息肉及健康人群。这表明NRP-1和NRP-2的表达水平与结直肠癌的发病亦有关。与相关研究[11]结果一致。

此外，我们亦检测了不同临床病理结直肠癌患者血清中NRP-1，NRP-2的表达水平。经RT-PCR检测，我们发现，NRP-1和NRP-2的表达水平与结直肠癌患者的年龄无明显相关性，但NRP-1和NRP-2水平与结直肠癌患者的病理分期及分化程度明显相关。结直肠癌患者出现肝转移及淋巴结转移预示着患者预后差，而我们在研究中发现，伴肝转移和淋巴结转移的患者其血中NRP-1和NRP-2水平高于未出现肝转移和淋巴结转移的患者。表明NRP-1，NRP-2的水平与结直肠癌患者的预后亦密切相关。而相关性显示，结直肠癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈正相关，这表明NRP-1，NRP-2在结直肠癌的发病及病理变化过程中可能共同发挥作用。

结合相关研究，我们推测，NRP-1，NRP-2可能通过下述途径参与了结直肠癌的发病及病情进展：①NRP-1，NRP-2与VEGF家族有关成员相结合，促进恶性肿瘤细胞的增殖[12]；②NRP-1，NRP-2与配体SEMA家族成员相结合，促进结直肠癌肿瘤细胞的增殖及血管生成[13，14]；③NRP-1，NRP-2可以促进结直肠癌患者淋巴结的转移和恶性肿瘤细胞的侵袭[15]。

本研究不足之处在于样本量较少，因此对实验结果可能会造成一定的影响。本研究结果显示，结直肠癌血清NRP-1，NRP-2水平高于肠息肉及健康人群。血清NRP-1，NRP-2水平与结直肠癌的临床病理及预后密切相关，NRP-1，NRP-2可能共同起作用。

[1] 邹瞭南，吴畑华，刁德昌，等．三联疗法在结直肠癌合并梗阻治疗中的应用[J]．中华胃肠外科杂志，2015，18(1)：77-79．

Zou LN，Wu TH，Diao DC，et al．Triple therapy in the application of the colorectal cancer complicated with obstruction[J]．Chinese Journal of Gastrointestinal Surgery，2015，18(1)：77-79．

[2] 张立达，白阳秋，杨玉秀．分泌性白细胞蛋白酶抑制剂在结肠癌中的作用[J]．中华实验外科杂志，2015，32(7)：1695-1697．

Zhang LD，Bai YQ，Yang YX．Role of secretory leukocyte protease inhibitor expression in the tumorigenesis of colon cancer[J]．Chinese Journal of Experimental Surgery，2015，32(7)：1695-1697．

[3] Schmidt T，Strowitzki MJ，Reissfelder C，et al．Influence of age on resection of colorectal liver metastases[J]．J Surg Oncol，2015，111(6)：729-739．

[4] 陈晓露．白细胞介素4基因多态性与结直肠癌的易感性[J]．现代检验医学杂志，2015，30(5)：105-106，110．

Chen XL．Interleukin-4 gene polymorphisms and colorectal cancer susceptibility[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2015，30(5)：105-106，110．

[5] 董娟聪，张海芹，高 辉，等．神经纤毛蛋白1对非小细胞肺癌放射敏感性的影响[J]．中华放射医学与防护杂志，2014，34(11)：809-812．

Dong JC，Zhang HQ，Gao H，et al．Effect of neuropilin-1 on radio-sensitivity of non-small cell lung carcinoma[J]．Chinese Journal of Radiological Medicine and Protection，2014，34(11)：809-812．

[6] 孙 瑾，王 亮，娄卫华，等．shRNA沉默NRP-1基因抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞生长的体内外研究[J]．中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2015，50(4)：312-317．

Sun J，Wang L，Lou WH，et al．NRP-1/shRNA silencing suppresses nasopharyngeal carcinoma cell growth in vitro and in vivo[J]．Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，2015，50(4)：312-317．

[7] 2014年NCCN结直肠癌临床指南更新要点[J]．中国全科医学，2014，17(30)：3539．

Updating points of 2014 NCCN colorectal cancer clinical guidelines[J]．Chinese General Practice，2014，17(30)：3539．

[8] Liu Y，He G，Wang Y，et al．MCM-2 is a therapeutic target of Trichostatin A in colon cancer cells[J]．Toxicol Lett，2013，221(1)：23-30．

[9] 王钦君，张红春，申娴娟，等．MicroRNAs作为结直肠癌潜在标记物的研究进展[J]．现代检验医学杂志，2015，30(4)：107-110，114．

Wang QJ，Zhang HC，Shen XJ，et al．MicroRNAs as a potential marker in the progress of colorectal cancer[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2015，30(4)：107-110，114．

[10] 安吉洋，宋锦宁，王军锋，等．大鼠弥漫性轴索损伤后突起坍塌蛋白Sema3A及其受体neuropilin-1的表达[J]．西安交通大学学报(医学版)，2014，35(6)：753-759．

An JY，Song JN，Wang JF，et al．Expressions of se-maphorin 3A and neuropilin-1 in the brain after diffuse axonal injury in rats[J]．Journal of Xi’an Jiaotong University(Medical Sciences)，2014，35(6)：753-759．

[11] McKenna CC，Munjaal RP，Lwigale PY．Distinct ro-les for neuropilin1 and neuropilin2 during mouse corneal innervation[J]．PLoS One，2012，7(5)：e37175．

[12] Maulik D，De A，Ragolia L，et al．Down-regulation of placental neuropilin-1 in fetal growth restriction[J]．Am J Obstet Gynecol，2016，214(2)：279．e1-9．

[13] Elahouel R，Blanc C，Carpentier G，et al．Pleiotrophin exerts its migration and invasion effect through the neuropilin-1 pathway[J]．Neoplasia，2015，17(8)：613-624．

[14] Pellet-Many C，Mehta V，Fields L，et al．Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury[J]．Cardiovasc Res，2015，108(2)：288-298．

[15] Groppa E，Brkic S，Bovo E，et al．VEGF dose regulates vascular stabilization through Semaphorin3A and the Neuropilin-1+ monocyte/TGF-β1 paracrine axis[J]．EMBO Mol Med，2015，7(10)：1366-1384．