通心络联合阿托伐他汀、阿司匹林对家兔动脉粥样硬化早期血管外膜滋养血管新生的干预作用

网络出版时间：2014-12-4 13:45网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.016.html

通心络联合阿托伐他汀、阿司匹林对家兔动脉粥样硬化早期血管外膜滋养血管新生的干预作用

郎艳松1，2， 秘红英1，2,刘红利2,袁国强3，4

(1. 河北医科大学中西医结合教研室，河北 石家庄050017；2.河北以岭医药研究院，国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，河北 石家庄050035；3.河北医科大学附属以岭医院心血管科(国家中医药管理局中医络病学重点学科)，河北 石家庄050091；4. 河北省络病重点实验室，河北 石家庄050035)

中国图书分类号：R-332；R322.121；R364.3；R543.5；R972.6

摘要：目的观察通心络联合阿托伐他汀、阿司匹林对家兔动脉粥样硬化早期颈动脉外膜滋养血管新生的影响。方法72只健康♀♂各半新西兰白兔随机分为对照组、模型组、通心络(TXL)组、阿托伐他汀(ATO)组、阿司匹林(ASP)组、金三角(ATS)`([1])组，各12只。对照组给予普通饲料、模型组及各用药组家兔均实施单侧颈动脉硅胶管包裹术复合高脂饲料喂养，TXL组给予通心络超微粉混悬液0.3 g·kg`(-1)·d`(-1)灌胃，ATO组给予阿托伐他汀2.5 mg·kg`(-1)·d`(-1)灌胃，ASP组给予阿司匹林12 mg·kg`(-1)·d`(-1)灌胃，ATS组给予通心络超微粉混悬液0.3 g·kg`(-1)·d`(-1)加阿托伐他汀2.5 mg·kg`(-1)·d`(-1)加阿司匹林12 mg·kg`(-1)·d`(-1)灌胃，连续给药4周后取材，HE染色观察颈动脉内中膜的变化；免疫组化法检测颈动脉外膜CD34表达情况；微球检测颈动脉微血管血流量的变化；RT-PCR和Western blot检测颈动脉组织中VEGF、VEGFR-2基因和蛋白表达情况。结果与对照组比较，模型组VEGF、VEGFR-2基因和蛋白表达以及微血管血流量明显增强(P<0.01)。与模型组比较，各用药组VEGF、VEGFR-2基因和蛋白表达以及微血管血流量明显减弱(P<0.01,P<0.05)。与其他用药组比较，ATS组VEGF、VEGFR-2基因和蛋白表达以及微血管血流量明显减弱(P<0.01,P<0.05)。与ASP组比较，TXL组、ATO组VEGFR-2蛋白表达均明显降低 (P<0.05)，ATO组微血管血流量减少明显(P<0.05)。TXL组与ATO组两组间比较差异无显著性(P>0.05)。VEGF、VEGFR-2基因和VEGF蛋白表达组间比较无统计学意义(P>0.05)。各用药组颈动脉外膜CD34表达减少。结论“ATS”方案有助于减少动脉粥样硬化早期颈动脉VEGF、VEGFR-2表达，抑制血管外膜滋养血管新生，减少促炎物质进入血管中膜、内膜，延缓动脉粥样硬化进程。

关键词：动脉粥样硬化；滋养血管；血管内皮生长因子；彩色微球；通心络超微粉；阿司匹林；阿托伐他汀

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.016

文章编号：

文献标志码：A1001-1978(2015)01-0071-06

收稿日期:2014-09-28,修回日期:2014-11-15

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(No 2012CB518606)

作者简介：郎艳松(1988-)，女，硕士,E-mail:769424369@qq.com ；

通讯作者袁国强(1977-)，男，博士，副主任医师，研究方向：中西医结合临床心血管病，,E-mail:yuanguoqiang7508@163.com

Abstract:AimTo observe the effect of a treatment proposal named“Golden Triangle”(Atorvastatin, Tongxinluo,and Aspirin) on the vasa vasorum angiogenesis of early atherosclerosis lesions in rabbits carotid artery.MethodSeventy-two healthy New Zealand rabbits with half males and half females were divided into 6 groups randomly(n=12):control group,model group, Tongxinluo group(TXL), atorvastatin group(ATO), aspirin group(ASP),golden triangle group(ATS).The control group was fed with common feedstuff, and all the other groups′ right carotid arteries were equipped with the silicone tube,and were then fed with fatty feedstuff.The Tongxinluo group, the Atorvastatin group and the Aspirin group were given suspension of Tongxinluo supermicro powder(0.3 g·kg`(-1)·d`(-1)),Atorvastatin(2.5 mg·kg`(-1)·d`(-1))and Aspirin (12 mg·kg`(-1)·d`(-1)),the golden triangle group were given suspension of Tongxinluo supermicropowder(0.3g·kg`(-1)·d`(-1)),atorvastatin(2.5 mg·kg`(-1)·d`(-1))and Aspirin (12 mg·kg`(-1)·d`(-1)). All the groups were fed with medicine for 4 weeks.Tissue slice of carotid artery was stained with HE and observed under light microscope.The change of blood liquid was detected by biochemical assay.Immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of CD34 around the carotid artery adventitia.Color microsphere method was used to detect the blood flow volume change of the cartoid artery microvascular. VEFG,VEGFR-2 gene and protein expression in the cartoid artery were detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultCompared with the control group,the content of VEGF,VEGFR-2 gene and protein expression and the microvascular blood flow volume of cartoid artery microvascular in the model were significantly increased(P<0.01).But those in each drug group were lighter than those in the model group(P<0.01,P<0.05).In the ATS group，the content of VEGF,VEGFR-2 gene and protein expression and the microvascular blood flow volume of cartoid artery microvascular were lower than those in the TXL，ATO and ASP group(P<0.01,P<0.05).Compared with the ASP group,the content of VEGFR-2 protein expression was significantly decreased(P<0.01)in the TXL and ATO group.VEGF,VEGFR-2 gene and protein expression in different subgroups showed no significant difference(P>0.05).The content of CD34 was decreased in TongxinLuo group,atorvastatin group,aspirin group and ATS group.ConclusionThe ATS project can reduce the expression of VEGF,VEGFR-2, inhibit the vasa vasorum angiogenesis and decrease proinflammatory substances in the tunica media and intima of vascular wall. It plays an important role in intervening in the process of AS.

血管外膜在动脉粥样硬化中的作用越来越受到重视[2]，血管外膜上有外弹力板、神经的终末分支、滋养血管以及结缔组织等，但近来研究发现在高胆固醇血症猪模型上，新生滋养血管出现及密度增加在动脉粥样硬化早期就已出现[3]，滋养血管新生程度与动脉粥样硬化严重程度相关，此外新生的滋养血管能够为促炎物质及促动脉粥样硬化血液成分进入血管壁提供通路[4]，易损斑块内的新生血管96.5%来源于血管外膜[5]。以往研究显示通心络[6]和他汀类药物[7]主要通过保护血管内皮、抗炎、抗氧化和调脂等作用发挥抗动脉粥样硬化的作用，阿司匹林[8]则主要通过抑制血小板活化、抗炎、抗氧化等机制延缓动脉粥样硬化的进程。此外通心络[9]、阿托伐他汀[10]、阿司匹林[11]均能够减少斑块内血管新生，起到稳定斑块的作用。根据polypill策略[12]，即在固定药物剂量的基础上联合用药，有研究者提出他汀类药物联合应用阿司匹林及中药通心络胶囊，形成有效防治缺血性心脑血管疾病的“金三角”(ATS)优选方案，在减少危险因素的同时未导致不良反应的风险提高，从而减少心脑血管的发病风险。因此，我们试图通过实验验证通心络联合阿托伐他汀、阿司匹林对动脉粥样硬化早期滋养血管新生的干预作用。

1材料与方法

1.1材料与设备3k15型高速冷冻离心机(Sigma)；T10型匀浆机(德国IKA公司)；JB-2A型恒温磁力搅拌器(上海雷磁新泾仪器有限公司)；756型紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；ABI 7300 Real-Time PCR System(美国ABI公司)；通心络超微粉(石家庄以岭药业股份有限公司，批号：20120924)；阿托伐他汀片(辉瑞制药有限公司，批号：1237179); 阿司匹林(石药集团欧意药业有限公司，批号：018130311)；羧甲基纤维素钠( 天津永大化学试剂开发中心，批号：20130418)；DYE-TRAK彩色微球(美国Triton Technology公司，批号：15TB0911)；VEGF鼠抗兔单克隆抗体(英国Abcam 公司，批号：ab1316)；VEGFR-2 山羊多克隆抗体(美国Santa Cruz公司，批号：sc-48161)。

1.2方法

1.2.1分组与造模健康新西兰白兔(北京富豪实验动物养殖中心，批号：SCXR[京]2010-0010)，单笼饲养于河北省络病重点实验室，体质量(1.8±0.2) kg，适应性饲养1周后，将72只健康清洁级新西兰白兔随机分为对照组、模型组、通心络(TXL)组、阿托伐他汀(ATO)组、阿司匹林(ASP)组、金三角(ATS)组，每组12只。对照组给予普通饲料，其余各组硅胶管包裹后给予高脂饲料(胆 固 醇1%，蛋黄粉7.5%，猪油5%，基础饲料86.5%，由河北医科大学实验动物中心加工定制)喂养[13]。自耳缘静脉注射3%戊巴比妥(1 mL·kg-1)，将新西兰白兔仰卧位固定于手术台上，脱毛后常规消毒，铺洞巾，沿其颈部正中线剪开皮肤，逐层钝性分离，右侧颈动脉鞘暴露后，仔细游离出右颈动脉(RCA)约2.5 cm。用准备好的的硅胶管纵向切开后包裹于RCA外，滴加青霉素预防感染。术后，缝合伤口，自主苏醒。术后2次/日，连续3 d局部消毒，以预防感染。对照组家兔不作任何处理。 每天12h间隔照明，温度20℃～25℃，湿度50%～70%，自由饮水和摄食。实验室每日按时通风和消毒。

1.2.2标本采集和处理喂养4周后，标本采集前12 h禁食禁水，3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉(1 mL·kg-1)，腹主动脉取血。严格无菌操作，剃毛后消毒，沿颈部正中线剪开，快速分离并取下包管侧颈动脉，生理盐水洗净，一部分4%多聚甲醛保存，另一部分液氮冻存备用。剩余组织制作石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色。

1.2.3病理标本光镜观察将已固定标本脱水、石蜡包埋切片(厚度约4 μm)，HE染色，光镜观察。

1.2.4免疫组化法检测血管外膜CD34表达取固定标本，脱水、石蜡包埋，切片,严格按照说明书行CD34免疫组织化学染色。

1.2.5彩色微球测量管壁微血管血流量

1.2.5.1测量原理自家兔左心室注入直径约为15 μm的彩色微球，随后微球随体循环至全身并最终嵌顿于微血管中，将待测标本中的彩色微球回收后，再用有机溶剂将彩色微球洗脱干净，利用紫外分光光度计测得吸光度值，用以计算待测标本的微循环血流量。

1.2.5.2测量方法用3%戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)耳缘静脉麻醉后，于右侧腹股沟处脱毛后常规消毒，剥离股动脉并插管(管内充满50 kU·L-1的肝素生理盐水，并与1 mL注射器相连)。胸部脱毛消毒，沿正中线剪开直至暴露心脏，10 s内将微球(500 μL含有1.2×106个黄色微球，最大吸光度波长448 nm)注射于左心室，在注射前5 s于股动脉插管持续采血1 min并抗凝。处死动物后迅速取出包管处颈动脉并放入聚丙烯离心管中，称量血液样本及组织样本重量。最后利用Triton Technology公司的Excel宏文件(Triton1 Plus Control)计算各组标本中管壁微血管血流量值(单位: μL/min·g)，实验具体操作方法严格按照说明书进行。

1.2.6VAGF/VEGFR-2的RT-PCR检测①组织总RNA提取及定量：取50 mg组织用TRIzol试剂(Gibco)提取组织总RNA。751紫外分光光度计测A260和A280值；以检测RNA纯度并定量。②RNA完整性鉴定，取总RNA液3 μL，加上样缓冲液1 μL，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察28S和18S条带的完整性。③逆转录-聚合酶链反应,逆转录cDNA的合成反应：取总RNA 6 μg，5×R．T．buffer 4 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)2 μL，Random primer 1 μL，RNasin(5×107U·L-1)0.4 μL，AMV-RT(1×107U·L-1)1 μL，DEPC-H20 3．6 μL，充分混匀后，42 ℃反转录 40 min，95℃ 5 min灭活反转录酶;引物合成：VEGF(73 bp)：上游5′-GCGTTCTCAGTGGTGTTTGA-3′，下游5′-TGGCTTGTTCCTCCTTCTTG-3′；VEGFR-2(141 bp)：上游5′-GGTTCAAAGACAACGAGATGC-3′，下游5′-TCACACAGCCAAGGACACTG-3′。GAPDH(92 bp)：上游5′-AGAGATTGTGCGGGATGTC-3′，下游5′-CCAGTGAGGAAGATGCTGCT-3′；PCR反应体系(25 μL)：R．T．product 5.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，primer each 1 μL，Taq DNA polymerase1 μL，DDW 13 μL；反应条件：94℃ 3 min，94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 45 s，30个循环；最后72℃延伸5 min。④RT-PCR产物半定量分析：取10 μL产物2%琼脂糖电泳(85 mA，125 V)50 min，用凝胶图像分析管理系统(珠海黑马有限公司)进行拍照和半定量分析，用任意单位(AU)表示凝胶谱带面积×荧光强度值，VEGFR/GAPDH的AU比值代表VEGFmRNA相对表达水平,VEGFR-2/GAPDH的AU比值代表VEGFR-2mRNA相对表达水平。

1.2.7VAGF/VEGFR-2的Western blot检测取颈动脉组织约100 mg，加入1 mL细胞裂解液，待充分裂解后进行定量，取蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完毕后对凝胶进行半干转膜。转膜完毕，取出PVDF膜，置于封闭液中并室温封闭2 h。将封闭后的PVDF膜置入稀释后的一抗溶液中，4 ℃缓慢摇动过夜。室温洗膜后，将PVDF膜置入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，室温反应2 h。抗体结合区带用化学发光法检测。以GAPDH作为内参照，以目的基因吸光度值/GAPDH吸光度值的比值表示检测样品中目的蛋白的相对含量进行数据统计分析。

2.1各组兔颈动脉光镜观察对照组：内皮细胞与内弹力板贴合紧密，内皮细胞连续结构完整。平滑肌细胞排列整齐；模型组：内膜层明显增生,内皮细胞不连续，内可见少量泡沫状巨噬细胞形成；各用药组内膜层部分增厚，但内膜损伤程度减轻，以阿托伐他汀组、通心络组及ATS组改善更为明显。见Fig 1。

2.2颈动脉壁CD34免疫组织化学染色CD34在颈动脉外膜微血管内皮细胞阳性表达呈现棕褐色，凡是呈现棕色的并与邻近组织有明显界限，可视为一个微血管；与空白组比较，模型组CD34在血管外膜新生滋养血管处表达增多；与模型组比较，各用药组外膜新生滋养血管数量减少(Fig 2中箭头所示)。2.3动脉微血管血流量的变化与空白组比较，模型组颈动脉微血管血流量增多，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，各用药组颈动脉微血流量减少(P<0.01)。ATS与其余各用药组比较微血管血流量减少明显(P<0.01)。ASP组微血管血流量改变与ATO组比较差异有统计学意义(P<0.05)，剩余两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见Tab 1。

Tab 1Comparison of microvascular blood

GroupMicrovascularbloodflowvolume/μL·min-1·g-1Control21.92±1.96Model55.8±2.57**TXL43.69±1.59##△△ATO41.75±1.05##△△ASP45.06±1.44##△△%ATS38.33±1.57##

**P<0.01vscontrol group:##P<0.01vsmodel group:△△P<0.01vsATS group:%P<0.05vsATO

2.4颈动脉外膜VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA的变化与正常组比较，模型组VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA 表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较，TXL、ATO、ASP、ATS组VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA 表达均明显降低 (P<0.01,P<0.05)。ATS组VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA 表达均低于ASP、TXL及ATO组(P<0.01)，两组间比较差异无显著性(P>0.05)。见Tab 2。

Fig 1　Appearance of carotid artery morphology in all groups(HE staining×400)

Fig 2　Appearance of CD34 in carotid artery adventitia in all groups(IHC×200)

GroupVEGFVEGFR-2Control1.05±0.161.01±0.18Model4.12±0.51**3.95±0.14**TXL2.17±0.26#△△2.06±0.06#△△ATO1.92±0.33#△△2.73±0.53#△△ASP2.07±0.5#△△2.46±0.51##△△ATS1.21±0.19#1.1±0.12#

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vsATS group

(P<0.01)。与模型组比较，TXL、ATO、ASP、ATS组 VEGF 蛋白表达均明显降低 (P<0.01,P<0.05)；ATS组 VEGF 蛋白表达均低于ASP、TXL及ATO组(P<0.01,P<0.05)，两组间比较差异无显著性(P>0.05)。

2.5各组颈动脉外膜VEGF、VEGFR-2蛋白水平与正常组比较，模型组VEGF蛋白表达明显升高与正常组比较，模型组VEGFR-2蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较，TXL、ATO、ASP、ATS组 VEGFR-2蛋白表达均明显降低 (P<0.01)；ATS组VEGFR-2蛋白表达均低于ASP、TXL及ATO组(P<0.01)，与ASP组比较，TXL组、ATO组VEGFR-2 蛋白表达均明显降低 (P<0.05)，两组间比较差异无显著性(P>0.05)。见Tab 3。

3讨论

随着对动脉粥样硬化研究机制的深入，血管外膜在动脉粥样硬化发生发展中的作用也越来越受到重视，滋养血管作为外膜中的一部分， 在动脉粥样硬化斑块形成之前，在动脉粥样硬化早期新生滋养血管就已出现[14]。新生的滋养血管同时也是炎性物质等进入血管壁的通路[4]。本实验中单侧颈动脉硅胶管包裹术复合高脂饲料喂养模型[15]是为了建立动脉粥样硬化早期滋养血管新生模型，以验证“金三角”方案对动脉粥样硬化早期滋养血管新生的干预作用。

Fig 3Expression of VEGF and VEGFR-2 protein in the

adventitia of common carotid artery in all groups

A：Control group；B：Model group；C：TXL group；D：ATO group；E：ASP group；F:ATS group

Tab 3Levels of VEGF and VEGFR-2 protein expression in the

GroupVEGFVEGFR-2Control0.04±0.010.27±0.02Model0.31±0.01**0.61±0.02**TXL0.24±0.01##△0.40±0.03#△aATO0.18±0.01#△△0.39±0.02#△aASP0.21±0.04#△0.47±0.05#△ATS0.11±0.03#0.31±0.05#

**P<0.01vscontrol group;#P<0.01,##P<0.05vsmodel;△P<0.01,△△P<0.05vsATS group;aP<0.05vsASP group

血管内皮生长因子(VEGF)特异的作用于血管内皮细胞，诱导内皮细胞的增生、迁移，从而发挥生理和病理性促血管新生的作用。VEGF促血管新生的作用主要通过两个特异表达血管内皮细胞的酪氨酸激酶受体：VEGFR-1和VEGFR-2，VEGF主要通过VEGFR-2促进内皮细胞增殖和新生血管形成[16]。VEGFR-2经过自身胞质内酪氨酸残基磷酸化，进而激活下游信号通路，促进内皮细胞的存活、增生和迁移，诱导新生血管形成，VEGF及其受体VEGFR-2通路是血管新生发生的主要通路。在滋养血管新生处可见大量VEGF、VEGFR-2表达[17]。采用彩色微球技术可较为准确的测定局部血流状况[18]，本实验采用该技术检测颈动脉上微血管的血流量，以间接证实颈动脉外膜滋养血管新生的程度。CD34可间接反映颈动脉外膜微血管数量[15]。

通心络、他汀类药物、阿司匹林均对斑块内新生血管有一定干预作用，此外，辛伐他汀可通过微血管内皮保护作用发挥抑制滋养血管异常增生的作用，但是他汀类的副作用不可避免，既往研究已证实，“金三角”方案减少西药副作用，上述实验已证实，3药联用组能明显减少VEGF/VEGFR-2基因和蛋白表达，另外3药联用组同时可明显减少颈动脉微血管血流量，其效果优于3药单用。“金三角”方案能够减少血管外膜新生滋养血管数量，使炎性物质进入血管壁的途径减少，从而为延缓动脉粥样硬化进程提供一种新途径。但是“金三角”抑制滋养血管新生的相关机制还有待于进一步研究。

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Interventional effects of Tongxinluo combined with Atorvastatin and

Aspirin(ATS) on the angiogenesis of vasa vasorum

in the early stage of atherosclerosis

LANG Yan-song1,2,MI Hong-ying1,2，LIU Hong-Li2,YUAN Guo-qiang3,4

(1.DeptofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;

2.DeptofCardiology,YilingMedicalResearchInstituteofHebeiProvince,KeyLaboratoryofStateAdministrationof

TraditionalChineseMedicine(cardio-cerebralvascularnetworkdisease),Shijiazhuang050035,China; 3.Deptof

CadiovascularDiseases,YilingHospitalofHebeiMedicalUniversity,KeyDisciplineofStateAdministrationofTraditionalChinese

Medicine,Shijiazhuang050091; 4.KeyLaboratoryofNetworkDiseaseofHebeiProvince,Shijiazhuang050035,China)

Key words:atherosclerosis;vasa vasorum;VEGF;color microsphere;Tongxinluo supermicropowder;Atorvastatin;Aspirin