固态发酵芦笋老茎生产反刍动物饲料培养基的优化研究

■王琳琳 张雪娇 周嘉倩 李俊杰 韩建荣

(1.河北农业大学理工学院，河北沧州 061108；2.山西大学生命科学学院，山西太原 030006）

芦笋，为百合科天门冬属多年生草本植物，又名石刁柏、龙须菜，在我国已有100多年的栽培历史，现已在山西、河南、四川大面积种植[1]。每年过了采收季节后，芦笋的地上茎仍继续生长，一般茎可高达2 m左右，这部分茎称为芦笋老茎[2]。大量的芦笋老茎无法利用，只能任其自然腐败或直接焚烧，既污染了环境，又造成了资源的浪费[3]。已有一些学者对芦笋茎、叶进行了营养成分分析，证明其营养成分极为丰富，且富含18种氨基酸，是值得开发的优质饲料资源[4]。

马玉胜等[5]对芦笋茎叶青贮饲料喂绵羔羊增重情况进行了研究，结果表明，试验组绵羔羊每只平均增重8.4 kg，对照组（喂青干草）每只平均增重6.6 kg，芦笋茎叶青贮料较青干草饲喂效果更好。韩光亮等[6]对奶牛食用芦笋茎叶青贮饲料后泌乳量进行了研究，结果日粮中添加芦笋茎叶青贮料的试验组日产标准奶20.54 kg，对照组（饲喂玉米秸秆青贮料）日产标准奶18.65 kg，提高10.13%。另外，利用微生物将秸秆转化为反刍动物饲料不仅能使资源得到合理利用，而且还增加了饲料种类、节省了粮食，同时这种方法对环境污染较小。但是目前研究大都集中在玉米、小麦、水稻等秸秆的生物降解，芦笋老茎做为反刍动物饲料的报道比较少见。

王琳琳等[7]通过单菌种固态发酵、复合菌种固态发酵以及不同比例的复合菌种固态发酵试验，对能够将芦笋老茎转化为反刍动物的微生物菌种进行了筛选。结果表明，芦笋老茎经配比为2∶2∶3的菌种组合青霉（Penicillium sp.）F-5、暗孢毛壳（Chaetomium atrosporum）F-21和曲霉（Aspergillus sp.）F-25发酵5 d后可溶性蛋白和粗蛋白含量分别提高了39.9%和38.5%，纤维素和木质素含量分别降低了1.85%和18.37%。这表明经发酵后，芦笋老茎蛋白和粗蛋白含量显著提高，木质素含量显著降低，同时纤维素含量得到了良好的保持，发酵产物的成分符合反刍动物的消化特点[8-9]，证明芦笋老茎经微生物发酵后能有效地转化为反刍动物的饲料。但是可溶性蛋白和粗蛋白的提高率还不是很大，这可能与发酵培养基的成分和发酵条件的设置有关，有待进一步优化研究。

为了进一步提高发酵产物中蛋白质的含量和降低木质素的含量，本研究利用筛选出的菌种组合F-5、F-21和F-25对芦笋老茎生料培养基进行固态发酵，通过对发酵培养基中含水量、氮源及其含量、辅料及其含量等单因素的研究，并进行了正交试验，以期得到最适的固态发酵培养基，为提高芦笋老茎利用效率提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

芦笋老茎，当年生，由山西阿林青谷农产品开发有限公司提供，自然风干后粉碎备用。

葡萄皮渣，制作葡萄酒的废弃物，由山西阿林青谷农产品开发有限公司提供，烘干粉碎后备用。

麸皮，购于太原市小店区附近农贸市场。

菌糠，为盆栽姬松茸的菌糠，由本实验室提供。

1.2 菌种

青霉（Penicillium sp.）F-5、曲霉（Aspergillus sp.）F-25、暗孢毛壳（Chaetomium atrosporum）F-21，由山西大学环境与资源学院李日强副教授提供，以上菌种保存在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上。

1.3 培养

菌种保存及活化培养基：PDA培养基。

液体种子培养基：参照李日强[10]稍作调整,配方为马铃薯200 g（加水煮沸过滤）、蔗糖20 g、芦笋老茎粉10 g、水l 000 ml，自然pH值。将70 ml液体培养基分装到250 ml三角瓶中，0.1 MPa灭菌20 min。

固态发酵培养基：由王琳琳等[3]研究可知，生料培养基作为固态发酵试验的培养基比较合适，即：芦笋老茎90%、麸皮8%、(NH4)2SO42%、含水量65%，自然pH值。配好后，直接分装到500 g的玻璃罐头瓶中，每瓶分装70 g培养基（湿重）。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

将3株菌分别接种于PDA斜面上，28℃培养活化。

1.4.2 液体种子的制备

用生理盐水将活化后斜面上的孢子洗下，并稀释成107个/ml的孢子悬液。将孢子悬液5 ml接入装有70 ml PDA液体种子培养基的三角瓶中，28℃摇床培养3 d。

1.4.3 固态发酵培养基优化单因素试验

1.4.3.1 含水量对发酵产物的影响

适合的含水量一方面使固态培养基颗粒间有一定的间隙，有利于空气的进入，增加传氧量；另一方面也促进了微生物新陈代谢产物的排出，保证新陈代谢的正常进行[11-12]。因此，培养基的含水量需控制在适当的水平。

本试验将1.3节中固态发酵培养基的含水量分别设置为60%、65%、70%、75%，其他条件不变。将复合菌种F-5、F-21和F-25(比例为2∶2∶3)以10%(v/w)的接种量进行接种，于28℃下进行固态发酵5 d。以1.3节中不接菌的固态发酵培养基为对照，测定发酵产物中的可溶性蛋白、粗蛋白、纤维素和木质素的含量，确定能显著降低木质素、较好保持纤维素含量，并能提高产物中粗蛋白和可溶性蛋白含量的最佳含水量。每个处理重复3次。

1.4.3.2 氮源对发酵产物的影响

不同氮源对微生物的生长有不同程度的促进作用；氮源含量高低也会直接影响发酵过程，过高不仅会造成资源浪费，还会抑制微生物的生长，过低会使得微生物难以得到充足的营养物质[13]。

本试验将1.3节中固态发酵培养基的氮源分别设置为2%尿素和2%(NH4)2SO4，其他条件不变。按照F-5、F-21和F-25比例为2∶2∶3以10%(v/w)的接种量进行接种，于28℃下进行固态发酵5 d，以1.3节中不接菌的固态发酵培养基为对照，测定指标及筛选方法同1.4.3.1节，确定出最佳氮源。

将筛选出的最佳氮源分别设置其含量为2%、4%、6%、8%，其他条件同1.3节中固态发酵培养基。按照F-5、F-21、F-25比例为2∶2∶3以10%(v/w)的接种量进行接种，于28℃下进行固态发酵5 d，以1.3节中不接菌的固态培养基为对照，测定指标及筛选方法同1.4.3.1节，确定出最佳氮源含量。

1.4.3.3 辅料对发酵产物的影响

在固态发酵中，添加一定量的辅料一方面可以补充芦笋老茎在发酵过程中碳源的单一性，另一方面还可以增加基质间的空隙，提高传氧量，从而有利于发酵[14-15]。本试验选取麸皮、菌糠、葡萄皮渣作为固态发酵中的辅料，并改变主料与辅料的配比，确定最佳辅料与含量。

本试验将1.3节中固态发酵培养基中辅料分别设置为8%麸皮、8%菌糠、8%葡萄皮渣，其他条件不变。按照F-5、F-21、F-25比例为2∶2∶3以10%(v/w)的接种量进行接种，于28℃下进行固态发酵5 d，以1.3节中不接菌的生料培养基为对照，测定指标及筛选方法同1.4.3.1节，确定出最佳辅料。

利用筛选出的最佳辅料，改变主料与辅料的比例，分别设置主料∶辅料=90%∶8%、87%∶11%、84%∶14%、81%∶17%，其他条件不变。按照F-5、F-21、F-25比例为2∶2∶3以10%(v/w)的接种量进行接种，于28℃下进行固态发酵5 d，以1.3节中不接菌的生料培养基为对照，测定指标及筛选方法同1.4.3.1节，确定出最佳主料与辅料的比例。

1.4.4 培养基优化正交试验

为了进一步优化发酵培养基的参数，在以上单因素试验基础上，选择含水量、麸皮含量、(NH4)2SO4含量进行L9（34）正交试验（表1）。

表1 L9（34）正交试验因素和水平

1.4.5 分析方法

可溶性蛋白的测定：采用考马斯亮蓝法测定[16]。

粗蛋白的测定：采用甲醛法测定[17]。

纤维素、木质素的测定：参照王玉万等（1987）的方法[18]。

2 结果与分析

2.1 含水量对发酵产物的影响

木质素是秸秆细胞壁的主要成分，它和纤维素、半纤维素通过酯键紧密地镶嵌在一起，形成坚固的酯链，包围着纤维素，使酶不易与纤维素分子接触，从而限制了瘤胃中细菌和真菌对纤维素和半纤维素的分解[19]。许多学者[20-21]表明，实现生物处理，提高秸秆饲用价值的理想菌株，必须能够选择性地降解木质素又不致造成纤维素大量消耗，才能使秸秆提供尽可能多的可消化的碳水化合物，进而提高秸秆的瘤胃消化率[3]。

表2 不同含水量对固态发酵产物营养成分的影响

从表2可以看出，与对照组相比，四种不同含水量发酵产物中可溶性蛋白含量均有所提高，当含水量为65%时达到最高，为（4.84±0.37）mg/g，但含水量为60%、65%和70%的三组间差异不明显；四组不同含水量发酵产物中粗蛋白含量虽均显著高于对照组，但在四组之间没有显著性差异，在含水量为75%时最高，为（10.76±0.33）%；与对照相比，四组不同处理发酵产物中纤维素的含量没有显著差异，均较好地保存了纤维素的含量；在含水量为65%和75%时，发酵产物中木质素的含量低于对照和其他两组，含水量为65%时，木质素含量最低，为10.50%。但含水量为65%时，可溶性蛋白显著高于含水量为75%。综上所述，选择65%为固态发酵培养基的最佳含水量。

2.2 氮源及其含量对发酵产物的影响(见表3)

表3 不同氮源对固态发酵产物营养成分的影响

由表3可以看出，不同的氮源对发酵产物中可溶性蛋白含量和粗蛋白含量均没有显著差别；以尿素为氮源的处理中纤维素含量高于以(NH4)2SO4为氮源的处理，且有显著差别，但木质素含量同样高于(NH4)2SO4为氮源的处理；以尿素为氮源的处理，在发酵过程中及未烘干之前有股比较浓的不愉快味道。综上所述，选择(NH4)2SO4为最佳氮源。

根据上述试验结果，选择(NH4)2SO4为最佳氮源，分别设置(NH4)2SO4含量为2%、4%、6%、8%然后测定发酵产物中的可溶性蛋白、粗蛋白、纤维素和木质素的含量，结果见表4。

从表4可以看出，不同(NH4)2SO4含量发酵产物中可溶性蛋白含量均显著高于对照组，但这四组间差异性不显著；在(NH4)2SO4含量为6%时粗蛋白含量最高，达到14.91%，与对照组相比显著提高；对于发酵产物中纤维素的含量而言，(NH4)2SO4的含量为2%时较好地保存了纤维素的含量，明显高于其他三组，为（21.75±0.33）%，与对照相比没有显著性区别；(NH4)2SO4的含量为4%和6%时，发酵产物中木质素的含量较对照组和其他组低，在(NH4)2SO4含量为4%时最低，为10.67%。(NH4)2SO4的含量为6%时发酵产物中纤维素的含量明显低于含量为4%组，且相差将近5个百分点；含量为4%时的发酵产物中粗蛋白含量略低于含量为6%时，但仅为1.07个百分点，综上所述及结合反刍动物的消化特点，选择(NH4)2SO4含量为4%为最佳氮源含量。

表4 不同(NH4)2SO4含量对固态发酵产物营养成分的影响

2.3 辅料及含量对发酵产物的影响（见表5）

从表5可以看出，以麸皮为辅料的发酵产物中可溶性蛋白含量最高，与对照组相比提高41.69%，以菌糠为辅料的发酵产物中次之，但二者没有显著性差异；分别以麸皮、菌糠为辅料的发酵产物中粗蛋白含量明显高于对照组和以葡萄渣为辅料的发酵产物中的含量，且菌糠为辅料的发酵产物中含量最高，为（10.58±0.27）%；三种辅料的发酵产物中纤维素的含量没有明显差别，且与对照相比相差不大；以麸皮为辅料的发酵产物中木质素的含量最低，与对照相比降解率达到了14.11%。

表5 不同辅料对固态发酵产物营养成分的影响

以葡萄皮渣为辅料的处理所得发酵产物中，可溶性蛋白和粗蛋白的含量明显低于其他两组；以麸皮和菌糠为辅料的处理所得发酵产物中各营养成分均没有显著差异，但是麸皮相对于菌糠来讲来源上比较广泛，综上所述，选择麸皮为最佳辅料。

在以麸皮为辅料的基础上，改变发酵配方的主料与辅料的配比，固态发酵培养基中主料与辅料的配比，结果见表6。

表6 不同主料与辅料比例固态发酵产物营养成分的影响

从表6可以看出，在主料∶辅料=81%∶17%的发酵产物中可溶性蛋白含量最高，达到(4.92±0.19)mg/g，比对照提高了43.44%，主料∶辅料=84%∶14%的发酵产物中可溶性蛋白含量最低，为(3.98±0.23)mg/g；在主料∶辅料=87%∶11%的发酵产物中粗蛋白含量最高，与对照相比提高了53.65%，在主料∶辅料=90%∶8%、87%∶11%、84%∶14%时发酵产物中纤维素含量与对照组相比没有显著性差异，降解不多；在主料∶辅料=87%∶11%、84%∶14%的发酵产物中木质素的含量显著低于对照组，且在主料∶辅料=87%∶11%时木质素含量最低，降解率达21.94%。

在主料∶辅料=87%∶11%和84%∶14%两组中木质素、纤维素、可溶性蛋白的含量没有显著差异，但是主料∶辅料=87%∶11%的发酵产物中粗蛋白的含量比主料∶辅料=84%∶14%中高，且有显著的差异性，综上所述，选取主料∶辅料=87%∶11%为最佳比例。

2.4 正交试验优化结果（见表7）

表7 正交试验结果与分析

从表7中可以看出，在所选的因素水平范围内，各因素对发酵产物中可溶性蛋白含量的影响大小顺序为C＞A＞B，优组合为A1B3C1；对粗蛋白含量的影响大小顺序为C＞A＞B，优组合为A3B1C2；对纤维素含量的影响大小顺序为B＞C＞A，优组合为A3B2C1；对木质素含量影响大小顺序为B＞A＞C,优组合为A1B1C2。

对于因素A，其对可溶性蛋白含量影响大小排第二位，此时取A1；其对粗蛋白含量的影响排第二位，此时取A3；对纤维素含量的影响排第三位，取A3；对木质素含量的影响排第二位，取A1，因此A因素可取A1或A3。取A1时，可溶性蛋白含量比取A3时提高0.22%，粗蛋白含量降低5.39%，纤维素含量降低2.87%，木质素含量降低9.05%。结合反刍动物的消化特点，因此A因素选择A1。

对于因素B,其对可溶性蛋白含量影响大小排第三位，取B3，为次要因素；对粗蛋白含量的影响排三位，取B1，为次要因素；对纤维素的影响排第一位，取B2；对木质素的影响排第一位，取B1，因此B因素可取B1或B2。取B1时，可溶性蛋白含量比取B2时降低0.46%，粗蛋白含量提高1.15%，纤维素含量降低1.38%，木质素含量降低4.51%。综上所述，B因素选择B1。

对于因素C，其对可溶性蛋白含量影响大小排第一位，此时取C1；对粗蛋白含量影响大小排第一位，此时取C2；对纤维素含量影响大小排第二位，取C1；对木质素含量影响大小排第三位，取C2，为次要因素。因此C因素可取C1或C2。取C1时，可溶性蛋白含量比取C2时升高14.04%，但粗蛋白降低了13.20%，纤维素升高4.61%，木质素升高4.9%。取C1时虽然木质素含量比取C2时稍高，但是节省了2%的(NH4)2SO4，降低了成本，更适应于扩大生产的要求。因此，C因素取C1。综上所述，固态发酵培养基的优组合为A1B1C1，即：芦笋老茎89%、麸皮9%、(NH4)2SO42%、含水量为62%，自然pH值。

3 讨论与结论

本试验所用菌种是通过筛选而获得的能有效将芦笋老茎转化反刍动物饲料的复合菌种。为了进一步提高其发酵效率，通过改变培养基中各营养物质的配比对培养基进行优化试验。

在试验过程中选取了培养基中含水量65%为适宜含水量。在发酵过程中可以发现含水量60%时，培养基比较干燥，隐约可以看到没有被浸湿的干料；含水量70%、75%时培养基较为湿润，尤其是含水量75%时培养基明显结块，有水滴浸出，这可能是过多的水分导致培养基内空隙较少，造成供氧不足造成的。

在氮源的选择上(NH4)2SO4和尿素的效果对发酵产物中各营养成分没有明显差别，但是在试验中发现以尿素为氮源的发酵过程中有浓烈的不愉快的味道，会影响饲料的适口性且考虑到降低生产成本而言，固选择了(NH4)2SO4为适宜的氮源；选取(NH4)2SO4含量为4%时为较适宜的氮源含量，过低的氮源含量达不到菌种生长所需的营养要求，含量过高在发酵过程中所造成的较低的pH值环境可能会抑制微生物的生长从而影响了发酵效果。

在辅料的选择上，麸皮与菌糠的效果没有显著差异，但本着节省成本和来源广泛的原则选择了麸皮作为辅料，主料∶辅料=87%∶11%为最佳比例，麸皮在一定程度上丰富碳源多样化的同时也起到了疏松作用，增加了氧气的通透率。

通过对单因素试验进行L9（34）正交试验，对发酵产物中各营养成分进行综合分析后可得出固态发酵芦笋老茎生产高蛋白反刍动物饲料的优化发酵培养基为：芦笋老茎89%、麸皮9%、(NH4)2SO42%、含水量62%，自然pH值。