菜籽粕芥子碱的热醇提取

2016-01-10邹成义斌屈东黄小丽

饲料工业 2016年9期

■余丹邹成义李斌屈东黄小丽

（1.四川省畜牧科学研究院饲料研究所，四川成都610066；2.四川农业大学动物科技学院，四川成都611130）

随着“低硫甙、低芥酸”的“双低”菜籽品种的大面积推广，芥子碱等多酚类物质将成为菜籽粕的最主要抗营养因子，在很大程度上限制其在工业饲料中的大量应用[1-2]。但是由于对菜籽粕芥子碱制备研究较少，其标准品价格昂贵，饲料领域对菜籽粕芥子碱的部分研究是通过在饲料中直接添加菜籽粕来完成的[3]。由于菜籽粕组分复杂，添加菜籽粕的试验结果并不能反映芥子碱的真实效果，因此研究菜籽粕芥子碱的分离提取方法，可为准确研究菜籽粕芥子碱的生理效应提供物美价廉的试验样品，还可为优化处理和高效利用饲用菜籽粕提供理论基础。目前芥子碱制备材料主要来源于白芥子等中草药[4]，制备的基本方法主要是热醇提取法，对提取效率要求高的可辅以微波提取法、超声波提取法或加速溶剂萃取法等[5-7]，对产品纯度要求高的再用柱色谱法或大孔吸附树脂法进行分离纯化[8]。目前菜籽粕芥子碱分离提取的研究相对较少，菜籽粕芥子碱含量的基础数据也非常缺乏。本试验以菜籽粕为芥子碱的主要来源，研究其芥子碱的热醇提取方法，确定菜籽粕芥子碱提取参数，测定菜籽粕芥子碱含量并对提取效果进行定性定量评价。本试验将建立菜籽粕芥子碱热醇提取方法，为进一步开展菜籽粕芥子碱的相关试验研究提供基础数据。

1 材料

1.1 样品及主要试剂

样品：菜籽粕样品由成都、德阳、绵阳、南充、达州等地市售的菜籽粕按质量比1∶1混合而成。

主要试剂：石油醚、无水乙醇、甲醇、硫氰化钾、浓盐酸、浓硝酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠等，均为分析纯；芥子碱硫氰酸盐标准品，购于成都市食品药品检测中心，含量99.5%。

1.2 主要试剂与仪器

粉碎机、恒温干燥箱、控温水浴锅、索式提取器、球形冷凝管、真空旋转蒸发仪、水循环真空泵、抽滤装置、紫外可见分光光度计、显微照相系统。

2 试验方法

2.1 菜籽粕的热醇提取[8]

2.1.1 菜籽粕预处理

除杂和粉碎：剔除菜籽粕中肉眼可见的杂物，粉碎，过60目筛，置40℃烘箱烘干至恒重。除残油：称取除杂粉碎后菜籽粕样品100 g，装入滤纸套中压实，浸入含石油醚的索式提取器的圆底烧瓶中，在70℃水浴中回流脱脂至恒重。

残油含量(%)=（脱脂前菜籽粕样品质量-脱脂后菜籽粕样品质量）/脱脂前菜籽粕样品质量×100。

2.1.2 菜籽粕的热醇粗提

将烘干后的脱脂菜籽粕盛装于圆底烧瓶，按照料液比1∶26，加入甲醇∶乙醇（体积比）=3∶5的溶剂，85℃水浴，从第1滴回流液体滴下开始计时，提取4 h。提取液用定量滤纸过滤，40℃、120 r/min真空浓缩至无醇味，得浸膏，称重。

浸膏提取率(%)=浸膏质量/脱脂前菜籽粕质量×100。

2.1.3 粗提物的纯化

用蒸馏水洗涤浸膏，将浸膏定容至50 ml，加入50 ml 20%KSCN溶液，置4℃冰箱48 h，析出结晶，用定量滤纸包裹抽滤干燥。将滤纸上的晶体称重，继续溶于40倍量(质量/体积)95%热乙醇中，溶液冷却后置4℃冰箱24 h，析出的晶体再用热乙醇重结晶，抽滤，40℃烘干，得淡黄色针状结晶。重结晶3次后称重。

晶体提取率（%）=晶体质量/脱脂前菜籽粕质量×100。

2.2 菜籽粕热醇提取物的鉴定

2.2.1 定性检测

显色反应：分别精确称取1 mg菜籽粕热醇提取物晶体和标准品，用蒸馏水定容至8 ml；分别吸取晶体溶液和标准品溶液滴至白反应板的3个反应孔内，每孔0.2 ml，再在孔内滴加不同液体，观察可见光和紫外光下的溶液颜色变化。具体滴加方案为在第1个孔内滴加去离子水，稳定后再滴加HCl；在第2个孔内滴加NaOH；在第3个孔内滴加浓HNO3，稳定后再滴加NaOH。

显微镜照相：将芥子碱硫氰酸盐对照品和菜籽粕热醇提取物晶体样品标本置于带照相系统的光学显微镜载物台上，分别放大4倍和10倍观察晶体结构并拍照。

2.2.2 定量检测

将芥子碱硫氰酸盐标准品置于干燥器中干燥24 h后，精密称取17.79 mg芥子碱硫氰酸盐标准品（标准品芥子碱含量为99.5%，则芥子碱的真实质量为17.70 mg），用甲醇定容到10 ml容量瓶中，摇匀，即得1.77 mg/ml的芥子碱硫氰酸盐标准溶液。用移液器分别准确吸取上述标准液10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210 μl各1份，加入碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液0.5 ml，再分别用去离子水定容至10 ml，依次配制成浓度为1.77、5.31、8.85、12.39、15.93、19.47、23.01、26.55、30.09、33.63、37.17 μg/ml的芥子碱硫氰酸盐标准品溶液。

准确称取浸膏2.00 mg或结晶1.00 mg，用甲醇定容至5 ml，摇匀后再吸取定容液200 μl，用去离子水定容至5 ml，在326 nm处测定吸光度。

浸膏和晶体检测液中芥子碱浓度计算公式为：y=(ax+b)，其中：y为浸膏或晶体的浓度；a和b为常数项，由标准曲线拟合回归方程得到；x为吸光度。

浸膏或晶体中芥子碱含量=芥子碱浓度×溶液体积×稀释倍数/浸膏或晶体测试取样质量。溶液体积为5 ml；稀释倍数为5/0.2=25倍；浸膏测试取样质量为2.00 mg，晶体测试取样质量为1.00 mg。

菜籽粕中芥子碱含量=晶体中芥子碱含量×晶体质量/菜籽粕样品质量。菜籽粕样品质量为100 g。

3 结果

3.1 菜籽粕粗脂肪和热醇提取物的含量

菜籽粕经过4次脱脂的残油、粗提后浸膏以及纯化后晶体的结晶含量如表1所示。本试验测定菜籽粕样品粗脂肪含量为7.60%，热醇粗提后的浸膏含量为10.01%，纯化后的晶体含量为2.54%。

表1 菜籽粕残油和热醇提取物含量

3.2 结晶物的定性检测

3.2.1 显色反应

菜籽粕热醇提取物与芥子碱硫氰酸盐在自然光和紫外光下的颜色反应如图1所示。E和H的第1排孔内为菜籽粕硫氰酸盐提取物溶液，第2排孔内为芥子碱硫氰酸盐标准品溶液；F和I分别为在E和H的第1～3列孔中依次加入去离子水、HCl和浓HNO3；G和J分别为在F和I的第1列和第3列孔内再加入NaOH溶液。E、F、G为自然光下的颜色反应结果；H、I、J为紫外光下的颜色反应结果。菜籽粕热醇提取物与芥子碱硫氰酸盐溶液在自然光下呈相同的淡黄色，紫外光下出现黄绿色荧光；滴加去离子水后颜色不变；滴加HCl后，在自然光和紫外光下均变成无色；滴加浓HNO3后，在自然光下变为红棕色，在紫外光下变成黄绿色；滴加去离子水的孔内再滴加NaOH后，在自然光下变为黄色，在紫外光下变成黄绿色荧光，滴加浓HNO3的孔内再滴加NaOH后，在自然光下变为橘黄色，在紫外光下变成黄绿色荧光。

图1 结晶物在不同条件下的显色结果

3.2.2 显微镜检测

菜籽粕晶体与芥子碱硫氰酸盐标准品晶体在4倍目镜的显微镜下的成像如图2所示，在10倍目镜的显微镜下的成像如图3所示。图2和图3的左图为芥子碱硫氰酸盐晶体，右图为菜籽粕热醇提取物结晶。

3.3 菜籽粕热醇提取物的定量检测

芥子碱标准溶液对应的OD值如表2所示，经回归分析，其回归关系为y=51.561x-0.009 4，R2=0.999。说明检测液浓度在1.77～37.17 μg/ml范围内，线性关系良好。浸膏、晶体和菜籽粕芥子碱含量如表3所示。浸膏和晶体检测液的OD值分别为0.272和0.368。经计算，浸膏和晶体检测液芥子碱浓度分别为5.46和7.32 μg/ml，则浸膏和晶体中芥子碱含量分别为68.22%和91.49%，菜籽粕的芥子碱含量为2.54%。

4 讨论

图2 菜籽粕晶体和芥子碱硫氰酸盐标准品放大4倍的显微成像

图3 菜籽粕热醇提取物结晶和芥子碱硫氰酸盐标准品晶体放大10倍的显微成像

表2 不同浓度芥子碱标准溶液OD值

由本试验结果可知，本研究收集的菜籽粕样品残油的平均含量为7.60%，此结果高于中国饲料成分及营养价值表（2014年第25版）发布的菜籽饼和菜籽粕的粗脂肪含量，出现这种差异的原因可能是提取方法的差异造成的。邢军等（2012）[9]研究证实：石油醚脱脂处理不影响油菜籽中芥子碱的含量，说明芥子碱主要存在于油菜籽的非油饼粕中，石油醚脱脂处理不会影响油菜籽的芥子碱含量。本研究也采用石油醚对菜籽粕进行前处理，这不仅不会对芥子碱造成损失，还能除去部分脂溶性杂质，有利于样品后期处理。

表3 浸膏、晶体和菜籽粕芥子碱含量

菜籽粕中热醇粗提物——浸膏含量占菜籽粕的10.01%，晶体含量达菜籽粕的2.54%。浸膏制备简单，成本低廉，省时省力，无毒无害，若替代菜籽粕用于一般的动物试验研究，可大大提高试验结果的准确性，但由于其还含有其它杂质，这些杂质的组分及其含量还需进一步检测确定；晶体制备程序相对复杂和耗时，但可用于实验室的定性和一般定量研究。

芥子碱为一种季铵盐生物碱，结晶体为针状，易溶于水、甲醇和乙醇等极性溶剂，在326 nm处有一紫外吸收峰。芥子碱水溶液无论在酸性还是碱性溶液中，都有明显的颜色变化。本研究中晶体在可见光及紫外光中不同酸碱条件下的颜色反应具有与芥子碱标准品相同的特征反应结果，证明本试验条件下分离纯化的晶体主要成分就是芥子碱。从显微照相的结果来看，芥子碱标准品主要以单晶体形式存在，晶体透明，颜色较浅；提取物晶体为多晶聚集体，晶体透明度较差，颜色略深。出现这种差异的原因可能在于提取物的纯度不如标准品高，所含杂质影响了晶粒结晶过程中的形状。结晶过程中，杂质可以通过影响晶体的成核、生长、团聚等过程改变晶体习性、粒径及粒度分布，导致晶体形态或对称性发生改变[10]。

芥子碱提取方法一般是采用热醇索氏提取，有的采用微波或超声波进行辅助提取。林燕妮等[7]建立了白芥子中芥子碱的微波、超声波辅助热醇提取的最佳条件。在芥子碱提取研究方面，常用的方法有：热醇提取、微波和超声波辅助提取等。本研究参照何江的提取工艺——提取时间3.93 h、提取温度85.5℃、甲醇乙醇体积比3∶5、料液比1∶26、20%KSCN溶液盐析、40倍量(质量/体积)的95%热乙醇反复重结晶，成功从菜籽粕中分离提取出了芥子碱晶体。目前芥子碱含量测定的方法主要有：雷氏盐法、四氯化钛法[11]、荧光测定法、紫外分光光度法[12]、高效液相色谱法[13]、电离质谱法[14]、毛细管电泳法等[15]。紫外分光光度法因其成本低廉、操作简单，常用于芥子碱的快速测定。芥子碱分子中含有一个较长的共扼体系，在紫外区326 nm处有一显著吸收峰，因此可用紫外分光光度计直接测定；芥子碱在pH值＞10的溶液中颜色变黄，最大吸收波长由326 nm转变为388 nm，据此也可采用可见分光光度法测定。在综合现有报道的基础上，本研究按照何江[8]的提取工艺进行芥子碱粗提、盐析和数次重结晶，获得的菜籽粕芥子碱浸膏和晶体分别占菜籽粕总量的10.01%和2.54%，采用紫外分光光度法测得浸膏和晶体中芥子碱纯度分别为68.22%和91.45%，即成都周边市售菜籽粕的芥子碱平均含量约为2.32%。目前，还未见可以参考的芥子碱相关的提取物的质量标准，但本研究的提取技术简单，对仪器设备要求不高，成本低廉，易于推广应用，所获得的芥子碱浸膏和结晶产品完全能够满足普通试验研究的需要。