气相色谱法快速测定青贮饲料中乳酸的含量
2016-01-10姚焰础
■宋 凡 陈 英 姚焰础
（重庆市畜牧科学院农业部养猪科学重点实验室养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆 402460）
随着人民生活水平提高和环境资源恶化，利用农 副产品和轻工副产物生产高质量、无污染的微生物发酵饲料已成为缓解饲料资源短缺、提高畜产品品质、减少药物残留、降低环境污染的重要手段[1]。乳酸菌在发酵过程中起着重要作用，其在厌氧条件下迅速繁殖产生大量乳酸，抑制其他不良微生物的生长繁殖，从而制成优质的微生物发酵饲料[2]。乳酸含量和组成比例是确定青贮饲料发酵特性和评价青贮品质的重要指标，因此，精确测定乳酸含量是青贮饲料研究中的一项重要分析技术。目前，乳酸含量的测定方法主要有羟基联苯比色法、EDTA定钙法、高效液相色谱法(HPLC)、酶法等，均有各自的适用范围和优缺点[3-6]。HPLC法、生物传感器法、乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高；EDTA定钙法检测虽然简便、迅速，但准确性最差；羟基联苯比色法检测效果居中，较为准确，但处理过程过于繁琐[7]。在SN/T1511.1—2005《进出口果汁中乳酸含量检验方法》基础上，笔者根据实际情况，摸索出一种能快速测定青贮饲料中乳酸含量的方法，操作简单易行、峰型良好，供大家参考。
1 试验材料
1.1 供试样品
重庆市畜牧科学院动物营养研究所研制的青贮饲料。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 主要仪器
日本岛津GC-2014C型气相色谱仪（氢火焰离子化检测器）、恒温水浴锅、20 ml具塞试管、涡旋混合仪、5 ml注射器、0.45 μm针头式滤膜。
1.2.2 试剂
浓硫酸、甲醇、三氯甲烷、乳酸标准品。
1.3 色谱条件
① 色谱柱：KB-FFAP（0.25 μm×0.25 mm×30 m）石英毛细管柱。
② 温度：柱温110℃，进样口温度250℃，检测器温度290℃。
③ 气体流速：载气（氮气）总流量32.4 ml/min，氢气40 ml/min，空气400 ml/min，尾吹30 ml/min。
④ 进样量：1 μl。
⑤进样方式：分流进样。⑥ 分流比：20.0。
2 测定方法
2.1 方法提要
青贮饲料中的乳酸，经甲醇-浓硫酸衍生化处理，三氯甲烷萃取，而后用配有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪测定，外标法定量[8]。
2.2 测定步骤
2.2.1 乳酸标准品制备
称取一定量的乳酸标准品，用纯水溶解并按需要配制成一系列不同浓度的乳酸标准溶液。
2.2.2 样品预处理
称取约10 g制备好的青贮饲料，精密加入100 ml纯水，混匀，置于4℃冰箱内充分浸提，用快速滤纸过滤，收集滤液备用。
2.2.3 衍生化处理
准确移取系列乳酸标准溶液及样品滤液各1 ml分别置于20 ml具塞试管中，加入2 ml50%硫酸水溶液及2 ml甲醇，混匀；于55℃恒温水浴30 min。取出冷却至室温，加入4 ml水，混匀，再准确加入2 ml三氯甲烷，充分混匀，静置。待完全分层后，用干燥吸管吸取下层三氯甲烷溶液于5 ml注射器内，过0.45 μm滤膜供GC分析。
3 结果与讨论
3.1 定性及定量分析
采用乳酸标准作保留时间定性及峰面积定量分析，采取面积外标法可测得乳酸的实际含量。
3.1.1 标准曲线绘制
将系列浓度标准酸溶液衍生化后上机测定，各乳酸标准溶液浓度、峰面积、线性方程及相关系数见表1，乳酸标准色谱图见图1、图2，标准曲线及线性方程见图3。
表1 各乳酸浓度、峰面积、线性方程及相关系数
图1 乳酸标准色谱图
图2 不同浓度乳酸标准色谱图比较
图3 乳酸标准曲线
3.1.2 青贮饲料样品乳酸测定
将衍生化后的青贮饲料样品上机测定，色谱图见图4。
图4 青贮饲料样品色谱图
3.2 方法精密度试验
3.2.1 标准精密度
取乳酸标准溶液(1 824 μg/ml)1 ml，按2.2.3制备测试样6份，测定结果见表2。
3.2.2 样品分析精密度试验
选择青贮饲料样品4#，按3.2.1中方法平行制备6份样品，测定结果及变异系数结果见表3。
由表3可见，该方法有较好的重复性与精密度。
3.3 回收率试验
3.3.1 空白加标回收
由表2可以得出，空白加标回收率平均为99.5%。
3.3.2 样品加标回收
称取相同的样品2号5份，其中3份加入高、中、低三浓度的乳酸标准物质，5份同时按相同的分析步骤分析，并计算出平均加标回收率为98.6%，结果见表4。
表2 乳酸标准溶液的测定结果
表3 青贮饲料样品乳酸测定结果
表4 样品回收率
4 结论
在SN/T1511.1—2005《进出口果汁中乳酸含量检验方法》基础上，建立的快速测定青贮饲料中乳酸含量的气相色谱法，具有出峰时间短（4 min以内）且峰型良好、样品处理简单、重复性与回收率较高等优点，在青贮发酵饲料的日常监测工作中值得推广和利用。
