棕榈酸包被γ-氨基丁酸对延边黄牛瘤胃微生物体内发酵特性的影响

■同仲彬 徐晓菲 J.S.Shin B.H.Moon 严昌国 李香子

(1.延边大学动物科学系，吉林延吉 133002；2.江原国立大学动物生命科学学院，韩国江源道春川，200-701；3.韩国Celltech生物饲料有限公司，韩国）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又名氨酪酸，是哺乳动物的一种中枢抑制性递质。GABA不仅在生物体内是一种重要的神经抑制因子，而且也参与多种生理活动，因此随着科学技术的发展以及研究方法的不断深入，GABA已作为一种新型功能性添加剂逐渐被应用于医药行业、食品行业及畜牧行业等各个领域。GABA具有调节动物食欲、调节激素分泌、增强动物免疫能力以及提高动物的抗氧化能力和抗热应激的能力。研究表明，氨基酸进入到瘤胃中会在瘤胃微生物的作用下部分或者完全降解，饲喂过瘤胃氨基酸是调控反刍动物小肠氨基酸数量与组成的有效途径，所以将氨基酸以某种方式有效地修饰或保护起来，这样能够减少瘤胃微生物降解氨基酸生成氮又利用氮合成微生物蛋白的这一过程中氮和能量的损失以及发挥氨基酸的重要功能。某些长链脂肪酸在瘤胃中时，不但不影响瘤胃的发酵且降解率比较低，而且在真胃中容易被消化，所以在棕榈酸包被GABA能够进入真胃和小肠进而在胃酸和脂肪酶的作用下放出氨基酸，GABA因此可以被反刍动物所吸收。J.B.Cheng等研究过瘤胃γ-氨基丁酸对热应激奶牛生长性能和养分消化率的影响，结果表明，添加过瘤胃GABA可以通过降低直肠温度，增加采食量来缓解热应激，并且可以增加产奶量，提高乳成分。对热应激奶牛GABA的最适添加量为40 mg/kg（干物质）。D.M.Wang等研究过瘤胃γ-氨基丁酸对羊羔采食量、生长性能和有关基因表达的影响，结果表明，添加过瘤胃GABA可以提高羔羊的干物质采食量，但是不影响其平均日增重，高添加量的GABA（140 mg/d）可以提高十二指肠黏膜GABA-β受体mRNA基因的表达量，抑制CCK-2受体mRNA基因的表达量进而引起羔羊采食量的增加。棕榈酸包被GABA虽然可以增加GABA的过瘤胃率，但是对延边黄牛瘤胃微生物是否存在负面影响、在小肠中的释放率如何，有没有发生过度保护？这些研究报道的还较少，所以本文研究棕榈酸（C16∶0）包被GABA对瘤胃微生物体内发酵特性的影响，为GABA这一物质应用于延边黄牛提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棕榈酸包被GABA：韩国Celltech生物技术公司与延边大学联合研制并提供，其中包被材料百分比含量为75%。

尼龙袋：孔径40 μm，大小为3 cm×8 cm的尼龙袋若干。

1.2 试验动物及饲养管理

选择4头体况接近并且安装瘤胃瘘管的延边黄牛，身体状况良好，体重接近[（350±15）kg]，平均年龄为18个月。将试验动物拴系饲养，固定槽位，每日7:00和16:00饲喂2次，精粗料比为3∶7，自由饮水。饲料参考中华人民共和国农业行业标准——肉牛饲养标准（NY/T815-2004）配制，干物质基础的日粮组成及营养水平见表1。

1.3 试验设计及培养方法

体内消化率试验：采取单因素试验设计，选取尼龙袋若干并在其中放入5 g棕榈酸包被GABA，封口后再称重。将6个尼龙袋用一根长绳固定到一起为一组，选择3头牛，于采食前投入每头牛瘤胃中一组，分别于食后2、4、6、8、12、24 h剪下每组中的3个尼龙袋，记录编号。将采集的尼龙袋立即放入清水冲洗直至水清为止，烘干称重。注意不能搓，任其清水自由冲洗，以免增大消化率。

表1 基础日粮组成及营养水平（干物质基础）

小肠消化率试验采用体外法进行。取在瘤胃液中降解16 h后的棕榈酸包被GABA，先用pH值为2的胃蛋白酶溶液将其处理1 h，在利用pH值为7.8的小肠混合液处理，于2、4、8、16、24 h之后分别取出，采用贝特洛法测定剩余GABA含量，以此来推算出GABA的消化率。

采用4×4拉丁方设计：设0（对照组）、2.3、4.6、6.9 g/kg(DM，干物质采食基础)这4个添加水平组；试验分为4期，每期15 d，其中预试期10 d，正试期5 d，试验期间隔为10 d。每日饲喂之前由瘤胃瘘管直接向瘤胃内投放包被GABA。分别于0（采食前）、1、3、6 h（采食后）采集瘤胃液，经4层、12层纱布过滤，-20℃冷冻保存待测。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 GABA体内消化率和小肠消化率测定

利用靛酚比色法对棕榈酸包被的GABA进行消化率的测定。

1.4.2 瘤胃液pH值、氨态氮（NH3-N）浓度和微生物蛋白(MCP)浓度的测定

使用赛多利斯酸度计（PB-10）分别即时测定不同时间点（1、3、6、12 h）所采集瘤胃液的pH值；利用靛酚比色法测定0、1、3 h和6 h时瘤胃液中NH3-N的含量；参照王宁娟等的方法，对瘤胃液中的MCP浓度进行测定。

1.4.3 培养液挥发性脂肪酸（VFA）浓度的测定

取0.8 ml培养液置于1.5 ml离心管中，并加入25%偏磷酸（H3PO4）0.2 ml，漩涡振荡混匀，离心15 min（12 000 g、4 ℃），取上清液进样。

参照Li等方法，选用Agilent Technologies GC-7890A气相色谱仪离子火焰检测器（FID），色谱柱型号为Agilent 19091F-112（25 m×320 μm×0.5 μm），采用外标法定量测定。色谱条件为：柱温120℃；前进样口与检测器温度分别设为170℃与200℃；氮气（载气）流速为26.43 ml/min；进样量1 μl。

1.5 数据处理

采用Excel 2007初步整理，SPSS 17.0统计分析，先用one-way ANOVA模型进行方差同质性检验，再运用常规线性模型（General Linear Model-Univariate），进行方差单变量分析，最后以Duncan's进行多重比较，显著水平采用P＞0.05，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 棕榈酸包被GABA在延边黄牛瘤胃中和小肠中的消化率

图1 棕榈酸包被GABA的消化率

由图1可知，2 h时，包被GABA消化率为4.62%，随着时间的延长，棕榈酸包被GABA的消化率随着时间的增加而逐渐增大，24 h后，棕榈酸包被GABA的消化率达到20.97%。利用体外法进行包被GABA在小肠中的消化率测定，结果显示棕榈酸包被GABA在小肠中16 h时的消化率为92.13%。

2.2 棕榈酸包被GABA对延边黄牛瘤胃微生物体内发酵特性的影响（见表2）

由表2可见，随着时间的增加，瘤胃液pH值呈现0（采食前）～3 h下降，3～6 h上升趋势，3 h时，4.6 g/kg组与6.9 g/kg组显著低于对照组与2.3 g/kg组（P＜0.05）。

由表2可见，随着采食后时间的增加，瘤胃液NH3-N呈现0（采食前）～1 h上升，1～3 h下降，3～6 h对照组与2.3 g/kg组上升，4.6 g/kg组与6.9 g/kg组下降的趋势，3 h时，4.6 g/kg组与6.9 g/kg组显著高于对照组与2.3 g/kg组（P＜0.05），6 h时，所有试验组均显著低于对照组（P＜0.05）。

由表2可见，随着采食后时间的增加，瘤胃液总挥发性脂肪酸（TVFA）、乙酸、丙酸、丁酸浓度均呈现0（采食前）～3 h上升，3～6 h下降的趋势。1 h时，丁酸浓度4.6 g/kg组显著高于对照组（P＜0.05）；3 h时，TVFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度均随着添加水平的增加呈现先增加后降低的趋势，在4.6 g/kg组出现高峰，其中TVFA与丁酸浓度4.6 g/kg组显著高于对照组与2.3 g/kg组（P＜0.05），乙酸浓度4.6与6.9 g/kg组显著高于对照（P＜0.05），丙酸浓度2.3与4.6 g/kg组显著高于对照（P＜0.05），乙酸/丙酸2.3 g/kg组显著低于对照组（P＜0.05）；6 h时，丙酸浓度2.3 g/kg组显著低于对照组与4.6 g/kg组（P＜0.05），丁酸浓度4.6 g/kg组显著高于对照组与2.3 g/kg组（P＜0.05），乙酸/丙酸2.3与6.9 g/kg显著高于对照组（P＜0.05）。

2.3 棕榈酸包被GABA对瘤胃液MCP的影响(见表3)

表3 棕榈酸包被GABA对瘤胃液MCP的影响(mg/ml)

由表3可见，随着采食后时间的增加，瘤胃液MCP浓度呈现与NH3-N相反的变化趋势，即0（采食前）～1 h下降，1～6 h持续上升的趋势，但各组间差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

韩占强等的研究表明，分别制备含棕榈油脂粉为30%、40%、50%和60%的保护性蛋氨酸，24 h时瘤胃降解率分别为39.18%、34.88%、26.04%、23.63%，24 h后瘤胃释放率分别为83.27%、73.05%、67.92%、56.80%。Berthiaume等运用尼龙袋法研究了过瘤胃蛋氨酸在瘤胃中的消失率为1、2、4、8、10、12 h和16 h的消失率分别为3.62%、9.22%、18.70%、31.90%、32.26%、36.74%和46.12%。Doreau等报道了17种饲粮中12～22碳原子偶数链脂肪酸在小肠内的消化率,试验结果表明，棕榈油(十六碳)和硬脂酸(十八碳)的平均消化率分别为77.1%和76.3%。王迪铭等研究表明，当使用固体棕榈油脂进行包被且GABA含量为50%，使用压力为11 kPa时所制得的包被GABA其在24 h时，GABA的降解率为18.2%，总下滑率为75.8%；本试验中，使用棕榈酸包被GABA，其在24 h时，GABA的消失率为20.97%，运用体外法测得其在小肠中的吸收率为92.13%，说明其在瘤胃中的稳定性比较高，起到了保护作用且在小肠中没有被过度保护，使得GABA没有很快被瘤胃微生物降解且棕榈酸对GABA的释放影响不大。

pH值的动态变化反映了瘤胃内有机酸以及唾液缓冲的相互作用，一般认为正常变动范围在6～7之间，当pH值小于6时，对瘤胃微生物有不利影响，初步表现为原虫与纤维分解菌的生长会受到抑制。本试验中，随采食初期进入瘤胃内的淀粉及可溶性碳水化合物被瘤胃微生物降解产生大量VFA，从而pH值下降，而后pH值上升，是由于瘤胃壁对VFA的吸收以及瘤胃液中弱碱性盐的缓冲作用，在采食3 h后，pH值明显降低了，并且不在瘤胃正常pH值范围内，而杨善军认为，添加棕榈酸能够提高pH值，Atasoglu等研究表明，一些氨基酸，如Met、Lys可能限制微生物的生长。所以本试验中pH值的下降不是由包被材料棕榈酸引起的，可能是由于GABA对瘤胃微生物代谢调节，抑制了厌氧微生物，如原虫或细菌的生长代谢，所以引起了pH值的下降。

NH3-N浓度反映了饲料粗蛋白在瘤胃内降解、微生物对氨的摄取利用以及瘤胃上皮对氨吸收的动态平衡，适宜的浓度是保证瘤胃微生物蛋白合成的首要条件，通常认为，5～28 mg/100 ml为NH3-N浓度适宜范围。本试验采食初期，瘤胃微生物种群迅速增殖，食糜中蛋白质降解，NH3-N浓度快速上升，1 h后，随着瘤胃微生物对NH3-N的利用，NH3-N浓度逐渐降低，至3 h时达到最低，微生物利用NH3-N的同时又加速了蛋白质的分解，NH3-N浓度又有回升的趋势，在3～6 h，NH3-N浓度都比较低，可能由于食糜中蛋白质不足，瘤胃微生物生长缓慢，碳水化合物分解利用受阻。GABA添加组与CON组相比提高了采食后3 h时NH3-N浓度，可能由于GABA本身作为氨基酸提供氮源。徐爱秋等研究表明，如果瘤胃中缺少特定的氨基酸底物则对瘤胃蛋白质降解菌生长有一定的抑制作用，说明氨基酸对微生物有一定的作用。本文中GABA作为氨基酸可能对瘤胃蛋白质降解菌的生长有一定的促进作用，提高了其降解蛋白质并利用其生产氨的活性，所以在采食6 h时NH3-N浓度降低，而且对照组同一添加量不同时间点NH3-H浓度的变化与对照组相比较变化较大，可能也是由于GABA对瘤胃蛋白质降解菌生长的促进作用。

VFA的主要作用是为反刍动物自身提供能源，其中乙酸、丙酸、丁酸占TVFA的绝大部分。瘤胃壁吸收乙酸后，将其输送到血液循环，再进入三羧酸循环（TAC）氧化供能，反刍动物所需葡萄糖主要来源于糖异生，而丙酸是糖异生的主要前体物质，同时心脏也利用部分丙酸。本试验中，不同水平添加GABA均不同程度地提高了TVFA及乙酸、丙酸的浓度，这与Bum Seung Ku和Dawson等的研究结果一致，Seung Kud等在体外培养瓶中加入2 000 mg/kg和5 000 mg/kg的GABA，结果表明，其可以提高TVFA及乙酸、丙酸的浓度，Dawson等认为，向瘤胃内灌注2 g/kg（DM）浓度GABA会提高丙酸的比例，丙酸的增加是由于GABA在生成琥珀酸的过程中产生二氧化碳，进而生成更多的丙酸。乙酸/丙酸与能量转化效率相关，本试验中，动物采食后3～6 h，GABA添加组乙酸/丙酸增加了。

4 结论

棕榈酸包被GABA在瘤胃内24 h的消化率为20.97%，体外法测得其在小肠中16 h消化率为92.13%。棕榈酸包被GABA降低延边黄牛采食3 h后瘤胃液pH值；棕榈酸包被GABA提高了延边黄牛采食3 h后瘤胃液NH3-N浓度，降低了采食6 h后瘤胃液NH3-N浓度；棕榈酸包被GABA增加了TVFA及乙酸、丙酸、丁酸的浓度以及3、6 h乙酸/丙酸。本试验条件下，4.6 g/kg的棕榈酸包被GABA更有利于延边黄牛瘤胃体内发酵。

（参考文献28篇，刊略，需者可函索）