培育颗粒对人绒毛滋养细胞侵袭与增殖的作用

培育颗粒对人绒毛滋养细胞侵袭与增殖的作用

王婧瑶1，孙丽萍1*，赵丕文1，梁欣韫2*

(1.北京中医药大学人体机能系，北京 100029；2.首都医科大学附属北京妇产医院中医科，北京 100026)

摘要：目的观察培育颗粒对人绒毛滋养细胞的侵袭和增殖功能的影响。方法取人妊娠5～10周正常胎盘绒毛,进行滋养细胞培养。正常23～25 d雌性SD大鼠药物灌胃，取药理血清。培养液加20%血清，分组培养48 h后检测指标。用Transwell侵袭实验检测培育颗粒对滋养细胞侵袭功能的影响，MTT法检测培育颗粒对滋养细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测培育颗粒对滋养细胞增殖核抗原(PCNA)表达的影响。结果Transwell侵袭实验检测结果表明,培育颗粒血清各剂量组与正常组侵袭细胞数均有差异,中剂量组侵袭细胞数最多。MTT法检测结果表明，培育颗粒血清各剂量组与正常组吸光度均有差异,中剂量组吸光度最高。流式细胞术检测结果表明，培育颗粒血清各剂量组与正常组PCNA阳性率均有差异，中剂量组PCNA阳性率最高。结论培育颗粒可促进人绒毛滋养细胞侵袭与增殖功能，可能与负反馈调节有关。

关键词：培育颗粒；侵袭；增殖；滋养细胞；负反馈调节

DOI::10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.07.022

中图分类号：R714.21文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)07-0719-04

基金项目:国家自然科学基金青年

作者简介:王婧瑶(1987-)，女，硕士研究生，主要从事中医药与生殖研究。

*通信作者:孙丽萍，电话-13681179069,电子信箱-slp201070@163.com

梁欣韫，电话-(010)52276423,电子信箱-fredalxy@163.com

Influence of the Peiyu particles on invasion and proliferation of human trophoblast cell

WANG Jingyao1,SUN Liping1*,ZHAO Piwen1,LIANG Xinyun2*

(1.Function of Human Body Department Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;

2.TCM Department Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital of Capital Medical University,Beijing 100026,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the Effect of the Peiyu particles on invasion and proliferation capabilities of human trophoblast cell.MethodsPlacental villi from normal pregnancy of 5 to 10 weeks were taken to culture trophoblast cells.Twenty percent pharmacological serum obtained from Peiyu particles-administered normal female SD rats (aged 23 to 25 days) was added in nutrient solution for culture.After being divided into groups,trophoblast cells were cultured for 48 hours.Then,invasion cell number,absorbance and PCNA expression rate of trophoblast cell in all groups were analyzed by TW invasion assay,MTT assay,and flow cytometry,respectively.ResultsTW assay results show that invasion cell number of each dose group of Peiyu particles is different from that of the normal group,and the invasion cell number of medium dose group is the highest.MTT assay results show that each dose group of Peiyu particles is different from the normal group in absorbance with absorbance of medium dose group being the highest.Flow cytometry results also show that there are differences between each dose group of Peiyu particles and the normal group in PCNA expression rate,and the PCNA expression rate of medium dose group is the highest.ConclusionPeiyu particles can enhance invasion and proliferation abilities of human trophoblast cell,and its effect may be dose-dependent.

Keywords:Peiyu particles;invasion;proliferation；trophoblast cell;negative feedback to adjust

中医认为早孕期间自然流产主要由于肾气不足，胎失所系，脾气虚弱，胎失所养，临床辨证以肾虚和脾肾两虚多见。培育颗粒由北京妇产医院赵松泉研制，组方包括桑寄生、菟丝子等补肾益精药，山药、黄精等健脾益气药，熟地黄、生地黄等滋阴养血药。全方补养肾气，健运脾气，滋阴养血，达到固胎的目的。前期临床实验已证实培育颗粒对脾肾两虚型早期先兆流产有较好的保胎作用[1]。人绒毛滋养细胞的侵袭与增殖功能是妊娠早期成功的关键，自然流产的发生常与绒毛滋养细胞侵袭和增殖功能不足有关。本实验研究培育颗粒对人绒毛滋养细胞的作用。

1实验材料

1.1试剂和耗材DMEM F12培养液、DPBS、抗PCNA荧光标记抗体(invitrogen)，2.5%胰蛋白酶储存液、Triton X-100、30%H2O2(biotopped)，Hank’s液、PBS缓冲液、DAB显色试剂(Solarbio)，胶原酶Ⅰ(Gene-bio)，免疫组化试剂盒(博士德)，抗角蛋白7单克隆抗体(Epitomics)，抗波形蛋白单克隆抗体(中杉金桥)，基质胶(BD)，DMSO(Amresco)，MTT(Sigma)，胎牛血清(EX cell)。Transwell-24膜嵌套TW小室(Corning)。

1.2动物23～25 d雌性SD大鼠，斯贝福(北京)实验动物科技有限公司。许可证号：SCXK(京)2011-0004。

1.3药物培育颗粒，首都医科大学北京妇产医院制剂，北京世纪坛医院配制加工。地屈孕酮(达芙通)：雅培生产。

1.4仪器CO2培养箱(SANYO，MCO-18AIC)，超净工作台(北京亚泰隆实验技术中心，022-2522)，低温离心机(SIGMA，3K15)，倒置显微镜(NIKON，TS100)，多功能荧光酶标仪(TECAN，SAFIRE2)，流式细胞仪(BD，FACS Canto II)。

2实验方法

2.1细胞培养取孕5～10周人工流产的正常胚胎的胎盘组织，洗净血迹,收集绒毛并剪碎。用含有1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰蛋白酶的Hank’s液消化，37 ℃，15 min，用与液消化同体积的20%胎牛血清的DMEN F12培养液终止消化，1 800 r/min室温离心15 min,弃上清。20%胎牛血清的DMEN F12培养液制备制成细胞悬液，调整浓度为1 000～10 000 mL接种于培养皿中，37 ℃，5%CO2培养。24 h后观察，部分细胞贴壁。

2.2滋养细胞纯度鉴定吸尽培养液，Hank’s液清洗。加入4%多聚甲醛的溶液,固定48 h，PBS漂洗。0.5%Triton X-100 (DPBS新鲜配制)，室温20 min，PBS漂洗。3%H2O2(蒸馏水新鲜配制)，室温15 min，DPBS漂洗。免疫组化试剂盒中的血清封闭液，37 ℃，20 min,甩干封闭液。分别用含有鼠抗人细胞角蛋白7单克隆抗体和含有鼠抗人细胞波形蛋白单克隆抗体的一抗血清封闭液封闭，37 ℃，2 h，PBS漂洗。试剂盒中的生物素化孵育，37 ℃，20 min，PBS漂洗。SABC孵育，37 ℃，20 min，PBS漂洗。DAB显色试剂1、2各50 μL，溶于900 μL PBS，避光显色15 min，自来水冲洗。

2.3制备药理血清将大鼠分组灌胃，地屈孕酮组，每次3 mg/kg。高剂量组，每次8 g/kg。中剂量组，每次4 g/kg。低剂量组，每次2 g/kg。对照组，蒸馏水，每次0.3 mL。每12 h灌胃1次，2次/d，3 d，第4天1次给全天量。1 h后取血，静置1 h，3 000 r/min，离心10 min，取血清。0.22 μm微孔滤膜的一次性过滤器过滤除菌，分装后-20 ℃保存。

2.4细胞分组培养取同一批传代、相同密度、相同大小培养皿培养的细胞6组，吸尽20%胎牛血清DMEM F12培养液，Hank’s液清洗，加入无血清的DMEM F12培养液，培养12 h。其中5组分别加入20%大剂量组血清、20%中剂量组血清、20%小剂量组血清、20%地屈孕酮组血清、20%正常组血清，继续培养48 h。

2.5Transwell小室侵袭实验在上室底铺基质膜，下室药理血清浓度为20%，上室药理血清浓度为15%，以保证药理血清对细胞的营养和特定作用，使下室细胞贴壁,用5%的血清浓度差保证细胞向营养高的下室侵袭。作用48 h后，对下室与培养孔内的细胞计数。

2.6MTT法检测培育颗粒对人绒毛滋养细胞增殖活力的影响将细胞悬液接种于96孔培养板，37 ℃、5%CO2培养，至细胞全部贴壁。吸尽细胞液，Hank’s液清洗，加入无血清DMEM F12培养12 h。用各药理血清分组处理，继续培养48 h。加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续孵育4 h。吸尽培养液，每孔加150 μL DMSO，震摇10 min，使紫色结晶物完全溶解。用多功能酶标仪测定波长为490 nm时吸光值。

2.7流式细胞术检测培育颗粒对人绒毛滋养细胞PCNA表达的影响收集细胞,PBS清洗。加入600 μL PBS，制成悬液，加入4 ℃预冷的无水乙醇1 400 μL，4 ℃固定。24 h后2 000 r/min离心15 min，弃上清，PBS清洗。加1 800 μL PBS制成细胞悬液，再加入200 μL小牛血清，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。含1%PCNA抗体的PBS液1 mL加入离心管重悬细胞，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。每管加入0.5 mL PBS重悬细胞，上机检测。

3实验结果

3.1人绒毛滋养细胞鉴定阳性细胞表面为棕黄色,阴性细胞表面无色。细胞角蛋白7染色阳性率大于90%，波形蛋白染色阴性率小于10%。表示所得细胞是绒毛滋养细胞。

3.2Transwell小室侵袭实验检测培育颗粒对人绒毛滋养细胞侵袭功能的影响见表1。

组 别侵袭细胞数无血清组 0±0##培育颗粒低剂量组20.7±0.6# 培育颗粒中剂量组25.7±0.6# 培育颗粒高剂量组17.0±1.0# 对照组 12.3±0.6 地屈孕酮组 31.3±5.1#

注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.3MTT法检测培育颗粒对人绒毛滋养细胞增殖功能的影响见表2。

组 别吸光度/A无血清组 0.110±0.005#培育颗粒低剂量组0.504±0.003#培育颗粒中剂量组0.557±0.008#培育颗粒高剂量组0.402±0.003#对照组 0.300±0.005 地屈孕酮组 0.603±0.008#

注：与对照组比较，#P<0.05

3.4流式细胞术检测培育颗粒对人绒毛滋养细胞PCNA表达的影响见表3。

组 别PCNA阳性率/%无血清组 4.0±0.6#培育颗粒低剂量组19.5±0.5#培育颗粒中剂量组28.2±0.4#培育颗粒高剂量组14.5±0.2#对照组 6.0±0.2 地屈孕酮组 28.3±0.4#

注：与对照组比较，#P<0.05

4讨论

角蛋白是构成上皮细胞骨架的蛋白，滋养层细胞是人胚胎绒毛组织中唯一的上皮细胞，而波形蛋白是内皮细胞和间质细胞的标志蛋白，因此滋养层细胞表现为抗角蛋白染色阳性、抗波形蛋白染色阴性[2-3]。不同类型细胞的角蛋白和广谱的细胞角蛋白没有滋养层细胞特异性，仅抗角蛋白7抗体对细胞滋养层细胞具有特异性，而且角蛋白7是唯一的不在间质细胞中表达的角蛋白[4]。因此，滋养层细胞的纯度鉴定可采用抗角蛋白7单克隆抗体和抗波形蛋白单克隆抗体来进行。本实验角蛋白阳性细胞90%以上,鉴定表明滋养细胞培养成功。

本实验采用血清药理学[5]的方法研究培育颗粒组方对细胞的作用。由于中药成分复杂，除了有效成分外，还有很多杂质，药物的酸碱度也会对体外实验的细胞产生影响。用含药血清代替中药粗提物作为药物源，接近药物在体内作用环境[6]。现代药理研究表明，补肾益气保胎中药可提高小鼠血清孕激素含量[7]。有研究报道，补肾中药具有提高患者血中孕酮含量的作用[8]。根据前期临床实验，培育颗粒可提高患者血清HCG值、孕酮值[1]。

Transwell小室的上下室间以膜孔直径为8.0 μm的聚碳酸酯膜相隔。在聚碳酸酯膜上室侧铺一层基质胶，模仿体内的细胞外基质，上室细胞要通过聚碳酸酯膜进入营养成分较高的下室，必须先分泌基质金属蛋白酶将基质胶溶解。计数进入下室的细胞数量，可反映细胞的侵袭能力[9]。有研究表明，补肾中药可增强滋养细胞侵袭功能[10]。本研究中，培育颗粒各组血清对滋养细胞的侵袭均有促进作用，地屈孕酮组作用最强。培育颗粒各组中，中剂量组作用最强，高剂量组作用较中剂量组减弱，可能与负反馈调节有关。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒,数量与活细胞数成正比，二甲基亚砜(DMSO)可以溶解细胞中的甲瓒。在490 nm波长处，用酶标仪测定其光吸收值(A),可间接反映活细胞的数量[11]。本研究中，培育颗粒各血清对滋养细胞的均有促进增殖作用。培育颗粒各组中，中剂量组作用最强，高剂量组作用较中剂量组减弱，可能与负反馈调节有关。

PCNA阳性的细胞率可作为细胞增殖程度的指标。有研究表明，自然流产患者滋养细胞PCNA表达降低[12-13]。本研究中，培育颗粒组各血清对滋养细胞均有促使PCNA表达增加的作用。培育颗粒各组中，中剂量组作用最强，高剂量组作用较中剂量组减弱，可能与负反馈调节导致体内相关活性物质减少有关。本研究表明，培育颗粒可通过增强人绒毛滋养细胞的侵袭与增殖能力，对防治妊娠早期自然流产起到一定的作用，其机制除提高患者血清HCG值、孕酮值，可能还与体内其他途径相关。